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天宇201266

金虫 (正式写手)

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专业: 生物化学

[求助] 关于Hind II 与Xho I酶切连接的问题，求大神指导已有6人参与

本人做Hind III与Xho I 的双酶切连接，一直没有做成，做了将近5个月了，自己将近机关算尽还是没有做出来，现想各位大神求助。现将自己的情况描述如下，自己通过PCR扩增，来获得目的片段510bp，获得的目的片段两端5'是Xho I 酶切位点，3'是Hind III酶切位点，而所要连得载体是pET-28a（之前已经插入一个启动子共5610bp），分别用Hind II 与Xho I双酶切载体与片段，
双酶切体系是：  目的片段/载体：5 ul
                        10x M buffer : 1ul
                        Hind III/Xho I  : 0.5ul
                        ddH2O       ：3ul
酶切之后的胶回收之后的跑胶电泳图如图片1
  酶切连接之后的单双酶切验证的体系是：
   双酶切验证：质粒          ：5 ul                                  Hind III 单酶切验证：质粒：5 ul          Xho I 单酶切验证：质粒：5 ul
                        10x K buffer : 1ul                                                       10x K buffer : 1ul                         10x K buffer : 1ul
                        Hind III/Xho I  : 0.5ul                                                       Hind III  : 0.5ul                                     Xho I : 0.5ul
                        ddH2O       ：3ul                                                             ddH2O       ：3.5ul                            ddH2O       ：3.5ul
单双酶切验证的图片如图2和如图3，图2与图3分别对应于同一个质粒。自己做酶切连接跟酶切验证的结果一直是这样，求各位大神指导，该如何设置片段与载体的比例？如何做酶切连接的体系，谢谢！

图片1.jpg