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天宇201266

金虫 (正式写手)

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[求助] 关于Hind II 与Xho I酶切连接的问题，求大神指导已有6人参与

本人做Hind III与Xho I 的双酶切连接，一直没有做成，做了将近5个月了，自己将近机关算尽还是没有做出来，现想各位大神求助。现将自己的情况描述如下，自己通过PCR扩增，来获得目的片段510bp，获得的目的片段两端5'是Xho I 酶切位点，3'是Hind III酶切位点，而所要连得载体是pET-28a（之前已经插入一个启动子共5610bp），分别用Hind II 与Xho I双酶切载体与片段，
双酶切体系是：  目的片段/载体：5 ul
                        10x M buffer : 1ul
                        Hind III/Xho I  : 0.5ul
                        ddH2O       ：3ul
酶切之后的胶回收之后的跑胶电泳图如图片1
  酶切连接之后的单双酶切验证的体系是：
   双酶切验证：质粒          ：5 ul                                  Hind III 单酶切验证：质粒：5 ul          Xho I 单酶切验证：质粒：5 ul
                        10x K buffer : 1ul                                                       10x K buffer : 1ul                         10x K buffer : 1ul
                        Hind III/Xho I  : 0.5ul                                                       Hind III  : 0.5ul                                     Xho I : 0.5ul
                        ddH2O       ：3ul                                                             ddH2O       ：3.5ul                            ddH2O       ：3.5ul
单双酶切验证的图片如图2和如图3，图2与图3分别对应于同一个质粒。自己做酶切连接跟酶切验证的结果一直是这样，求各位大神指导，该如何设置片段与载体的比例？如何做酶切连接的体系，谢谢！

图片1.jpg

图片2，Hind III 单酶切以及 Hind III +Xho I双酶切验证，从右向左一次是单双酶切.jpg

图片3，Xho I 单酶切以及 Hind III +Xho I双酶切验证，从左向右一次是双单酶切.jpg

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在路上。。。

1楼2015-10-16 13:53:15

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jukongka

铁杆木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
天宇201266: 金币+5, ★有帮助 2015-10-17 20:42:56

这个两个酶切位点应该是很好切，也好连。楼主做的时候一定要注意几点：
1.你PCR产物两端要各加3个保护碱基，一般HindIII加GGG，XhoI加CGG碱基，可以参考有关文献；这样才能保证酶能将PCR产物末端切开；
2.酶切体系中DNA量及酶切时间。PCR产物及载体量不宜过多，酶切时间要足够，现在快切酶10～15分钟可以切好，但还是建议切30分钟以上，载体可以切2h，酶切完全是试验成功的第一步。
3.一般来说载体和DNA片段1：3（摩尔比）连接效果比较好。一般情况下，由于载体碱基比DNA片段多2～3倍，从DNA电泳图看，载体和DNA亮度一样的量基本合适。