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天宇201266金虫 (正式写手)
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[求助]
关于Hind II 与Xho I酶切连接的问题，求大神指导 已有6人参与
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本人做Hind III与Xho I 的双酶切连接，一直没有做成，做了将近5个月了，自己将近机关算尽还是没有做出来，现想各位大神求助。现将自己的情况描述如下，自己通过PCR扩增，来获得目的片段510bp，获得的目的片段两端5'是Xho I 酶切位点，3'是Hind III酶切位点，而所要连得载体是pET-28a（之前已经插入一个启动子共5610bp），分别用Hind II 与Xho I双酶切载体与片段， 双酶切体系是： 目的片段/载体：5 ul 10x M buffer : 1ul Hind III/Xho I : 0.5ul ddH2O ：3ul 酶切之后的胶回收之后的跑胶电泳图如图片1 酶切连接之后的单双酶切验证的体系是： 双酶切验证 ：质粒 ：5 ul Hind III 单酶切验证 ：质粒：5 ul Xho I 单酶切验证：质粒：5 ul 10x K buffer : 1ul 10x K buffer : 1ul 10x K buffer : 1ul Hind III/Xho I : 0.5ul Hind III : 0.5ul Xho I : 0.5ul ddH2O ：3ul ddH2O ：3.5ul ddH2O ：3.5ul 单双酶切验证的图片如图2和如图3，图2与图3分别对应于同一个质粒。自己做酶切连接跟酶切验证的结果一直是这样，求各位大神指导，该如何设置片段与载体的比例？如何做酶切连接的体系，谢谢！  图片1.jpg  图片2，Hind III 单酶切以及 Hind III +Xho I双酶切验证，从右向左一次是单双酶切.jpg  图片3，Xho I 单酶切以及 Hind III +Xho I双酶切验证，从左向右一次是双单酶切.jpg |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
天宇201266: 金币+1, ★有帮助 2015-10-20 20:12:20
感谢参与，应助指数 +1
天宇201266: 金币+1, ★有帮助 2015-10-20 20:12:20
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每次批量操作10个载体的经验来说，片段和载体比例不是重要的。要点是酶切彻底，回收试剂盒好，回收电泳要换新的电泳也。 发自小木虫Android客户端 |
7楼2015-10-16 23:36:18
【答案】应助回帖
商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
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感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 请勿刷应助指数，已经看到您很多次无用的应助了。谢谢你的理解与配合。 2015-10-16 20:21:18
天宇201266: 金币+1, 老板不会同意的 2015-10-17 20:41:23
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myprayer: 请勿刷应助指数，已经看到您很多次无用的应助了。谢谢你的理解与配合。 2015-10-16 20:21:18
天宇201266: 金币+1, 老板不会同意的 2015-10-17 20:41:23
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建议还是送到公司来做吧，比较省事，价格也不贵，做不出还不收费：http://www.tolobio.com/service_detail.php?id=110 相亲咨询：support@tolobio.com |
2楼2015-10-16 15:39:15
wxb2061
银虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 283
- 散金: 60
- 帖子: 135
- 在线: 23.2小时
- 虫号: 2901790
- 注册: 2013-12-29
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
3楼2015-10-16 18:19:36
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4楼2015-10-16 18:36:10
100