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我现在在做分子克隆的实验，骨架和片段都是用ASCI酶切的，大小分别是：6219bp、6422bp，T4连接酶连，16度5、6个小时或者过夜，骨架和片段体积比是1:7，长斑的情况不定，有时多有时少，做菌液电泳有时候有滞后的但酶切检测不对，做了三个多月了， ，担心我的毕业 望大家给些高见啊 |
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 虫友问答-分子生物 |
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dorecnu
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-09-28 22:55:11
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-09-28 22:55:11
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PCR产物是否是回收后直接酶切？如果是请将片段连到simple 19T载体上之后再酶切。 新手往往觉得我在PCR引物末端设计了酶切位点和保护碱基就万事大吉了，实际经验是NONONO 在载体和片段连接过程中有一个重要的环节是酶切位点是否都完整，PCR产物直接酶切的 弊端是不知道插入 片段酶切位点的状况。先将片段链接到T载体后酶切，可以清楚的获得这一状态。 然后在将载体用碱性磷酸酶去磷酸化后按载体：片段=1：3的比例连接。 先连T载体看起来繁琐，实际上每个过程都能检测，实际上有助于后续实验更快的进行。 连接酶在室温工作挺好，且可以节约时间。 |
7楼2015-09-28 19:44:08
wuyuanqing
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2楼2015-09-25 23:23:27
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6楼2015-09-28 19:08:01
jackyoung
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-28 22:55:31
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-28 22:55:31
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建议比例换成1:3或1:2，载体务必去磷酸化，鉴定时酶切应该不好判定结果，可以选择片段上的单酶切位点切，也可以用Asc 1加载体或片段上的组合酶切。如此，祝好。 发自小木虫Android客户端 |
8楼2015-09-28 20:00:42
9楼2015-09-29 00:49:24
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10楼2015-09-29 05:03:47