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xiamuxi

新虫 (小有名气)

[交流] 克隆相关 已有8人参与

我现在在做分子克隆的实验，骨架和片段都是用ASCI酶切的，大小分别是：6219bp、6422bp，T4连接酶连，16度5、6个小时或者过夜，骨架和片段体积比是1:7，长斑的情况不定，有时多有时少，做菌液电泳有时候有滞后的但酶切检测不对，做了三个多月了，，担心我的毕业望大家给些高见啊
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生活需要信仰。
1楼 2015-09-25 21:48:31
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

dorecnu

木虫 (正式写手)
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-09-28 22:55:11
PCR产物是否是回收后直接酶切？如果是请将片段连到simple 19T载体上之后再酶切。
新手往往觉得我在PCR引物末端设计了酶切位点和保护碱基就万事大吉了，实际经验是NONONO
在载体和片段连接过程中有一个重要的环节是酶切位点是否都完整，PCR产物直接酶切的 弊端是不知道插入
片段酶切位点的状况。先将片段链接到T载体后酶切，可以清楚的获得这一状态。
然后在将载体用碱性磷酸酶去磷酸化后按载体：片段=1：3的比例连接。
先连T载体看起来繁琐，实际上每个过程都能检测，实际上有助于后续实验更快的进行。
连接酶在室温工作挺好，且可以节约时间。
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7楼2015-09-28 19:44:08
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普通回帖

wuyuanqing

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
单酶切？试试载体去磷酸化

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2楼2015-09-25 23:23:27
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iszku

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
是不是酶切过了？

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3楼2015-09-26 03:10:58
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海里的淡水鱼

禁虫 (小有名气)
★
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4楼2015-09-26 09:28:30
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xiamuxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wuyuanqing at 2015-09-25 23:23:27
单酶切？试试载体去磷酸化

载体都去磷酸化了的
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生活需要信仰。
5楼2015-09-28 19:06:28
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xiamuxi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by iszku at 2015-09-26 03:10:58
是不是酶切过了？

哦？我基本都是切4个小时左右的，怕切不彻底啊。。还有切过这一说啊？怎么检测是不是切过了呢？
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生活需要信仰。
6楼2015-09-28 19:08:01
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jackyoung

新虫 (正式写手)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-28 22:55:31
建议比例换成1:3或1:2，载体务必去磷酸化，鉴定时酶切应该不好判定结果，可以选择片段上的单酶切位点切，也可以用Asc 1加载体或片段上的组合酶切。如此，祝好。

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CestLaVie
8楼2015-09-28 20:00:42
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iszku

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by xiamuxi at 2015-09-28 19:08:01
哦？我基本都是切4个小时左右的，怕切不彻底啊。。还有切过这一说啊？怎么检测是不是切过了呢？...

酶切太过了可能会影响下一步的酶连接，通常酶切30-60分钟已经足够

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9楼2015-09-29 00:49:24
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chuji79

禁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
10楼2015-09-29 05:03:47
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