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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 大肠杆菌培养出现严重问题，紧急求助
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feiadafeng

银虫 (小有名气)

[求助] 大肠杆菌培养出现严重问题，紧急求助已有8人参与

最近实验室摇菌出现下列问题，不知道是否为噬菌体，希望有经验的诸位能够给出一些建议。
1. 在相同的培养箱当中，同时进行小管摇菌，一些管子明显不生长，或生长缓慢。培养基相同，抗生素相同，单菌落来自用已确定序列的质粒转化的BL21。
2. 在相同培养条件下，进行200-1 L培养时，初期生长没有问题。OD达到0.45-0.8左右进行诱导。平行3或4瓶时会出现一瓶16度24小时OD只到0.9左右，或OD到2或3但收菌时上清有絮状物浮沫。所有培养基、瓶子都已灭菌，IPTG已用.22微米滤膜过滤，取样测OD时同时在开放环境或超净台中取样于离心管中。
3. 采用TB表达时，5000g以下转速收集的菌体呈现偏绿褐色的豆腐渣状态，无法集中在瓶底，而且明显OD值很低。已知实验室相同菌株在相同条件下表达，菌体会呈现黄色或淡红褐色状态。
上述情况在多瓶或多管表达时尤其明显，但并非是所有样品都会出现上述情况。而且所有大量表达的实验在诱导前生长状态良好，似乎不是菌株自带污染。
希望大家能提供一些经验，谢谢！
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1楼2015-08-21 22:46:22
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feiadafeng

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hajierlove at 2015-08-21 23:00:53
我也遇到相同问题

请问你们是怎么解决的？
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5楼2015-08-22 15:45:17
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yuhan131481

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
feiadafeng: 金币+3 2015-08-25 12:16:02
典型的噬菌体污染了，把所有的瓶子用氢氧化钠侵泡，160℃高温烘烤、洗干净后再灭菌。摇床培养箱用氢氧化钠溶液擦洗之后再用酒精擦下。然后实验停止一周左右的时间。基本就好了。
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10楼2015-08-25 11:28:21
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普通回帖

hajierlove

铜虫 (正式写手)
我也遇到相同问题
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踏实
2楼2015-08-21 23:00:53
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huangxin2011

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
温度
*************
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3楼2015-08-22 10:58:29
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feiadafeng

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huangxin2011 at 2015-08-22 10:58:29
温度
*************

可以解释一下为什么是温度的原因么？因为低温表达并不存在这种情况，之前也并没有观测到这种现象。
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4楼2015-08-22 15:42:57
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mazhenggen

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先要确定不是染菌，再研究一下是不是外源蛋白对大肠杆菌有毒性。不像是噬菌体感染

[ 发自小木虫客户端 ]
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我喜欢所以我做
6楼2015-08-23 11:40:09
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huangxin2011

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by feiadafeng at 2015-08-22 15:42:57
可以解释一下为什么是温度的原因么？因为低温表达并不存在这种情况，之前也并没有观测到这种现象。...

具体的我也不清楚，因为之前课题组里面有人养菌，由于温度不对，OD在0.2~0.3测完之后急剧下降，最后变澄清了。那是25度培养，后来换成18度就对了，因为文献上是18度，当时机器坏了就选了25度。
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7楼2015-08-24 08:47:50
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syhzlsd

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
feiadafeng: 金币+2 2015-08-25 12:15:47
我也遇到过这种情况，你这种现象像是溶菌了，有可能是操作或者是你用的抗生素，诱导剂污染的原因。如果说是你的蛋白对宿主有毒性，那就会全都溶菌，不会部分溶菌。另外，你提到第一种小管摇菌的现象，有可能是你的平板被污染了或者是假性菌落较多。还有你挑菌落是用的吸头吗？吸头也有可能造成污染。
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8楼2015-08-24 09:15:41
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
feiadafeng: 金币+2 2015-08-25 12:15:53
我以前做蛋白表达纯化时也遇到这种情况，我的是溶菌了，注意操作（尤其是平板）
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
9楼2015-08-24 11:05:29
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