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zeroon木虫 (正式写手)
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[求助]
做亚细胞定位，主要是定位液泡，请问融合蛋白表达载体应该如何构建呢 已有2人参与
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看到文献中，液泡中的的蛋白酶——羧肽酶，常作为marker蛋白定位，既给这个蛋白融合一段gfp，然后在细胞内即可定位液泡的位置。 但是找了好多文献，都没具体写清楚分子构建那地方是怎么样的。 我应该在羧肽酶基因的后面直接跟着加上gfp序列呢，还是中间隔开几个序列再加？看到这篇文献Visualization of vacuoles in Aspergillus oryzae by expression of CPY–EGFP。 里面提到First,the CPY–EGFP expression plasmid was constructed to constitutively express CPY–EGFP fusion protein,which contains six amino acids between CPY and EGFP,under A. oryzae pgkA promoter,which is a constitutively expressing strong promoter of 3-phosphoglycerate kinase gene。 我觉得好奇怪啊，为什么在CPY和EGFP之间加入6个氨基酸呢？而且这篇文章通篇也没写清楚到底这6个氨基酸是什么？ 求做过相关研究的大神给与指导，不慎感激。 |
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【答案】应助回帖
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zeroon: 金币+5, ★有帮助, 额，谢谢，可能懂了一些 2015-08-22 22:00:49
zeroon: 金币+5, ★有帮助, 额，谢谢，可能懂了一些 2015-08-22 22:00:49
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融合蛋白就是把你基因和GFP表达后融合在一起。我们这么亚细胞定位常做，很容易。 说白了就是有一个原核表达的空载，确定空载的GFP在多克隆位点的前边还是后边，如果GFP在多克隆位点的前边，那么在多克隆位点直接插入你目标基因（此处是你液泡羧肽酶基因，注意不要碱基移码）；如果GFP基因是在多克隆位点后边，那么把你目标基因去掉终止密码子插入多克隆位点（同上，注意插入位点到GFP起始密码子ATG，此段不要碱基移码），然后转染拟南芥染色质体或者基因枪洋葱表皮，就可以在共聚焦显微镜下观察了。 说了这么多，不知道你懂了没有。 |
7楼2015-08-22 19:03:11
2楼2015-08-19 01:24:47
3楼2015-08-19 01:27:35
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赵zhao赵
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