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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 做亚细胞定位，主要是定位液泡，请问融合蛋白表达载体应该如何构建呢
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zeroon

木虫 (正式写手)

[求助] 做亚细胞定位，主要是定位液泡，请问融合蛋白表达载体应该如何构建呢 已有2人参与

看到文献中，液泡中的的蛋白酶——羧肽酶，常作为marker蛋白定位，既给这个蛋白融合一段gfp，然后在细胞内即可定位液泡的位置。
但是找了好多文献，都没具体写清楚分子构建那地方是怎么样的。

我应该在羧肽酶基因的后面直接跟着加上gfp序列呢，还是中间隔开几个序列再加？看到这篇文献Visualization of vacuoles in Aspergillus oryzae by expression of
CPY–EGFP。
里面提到First,the CPY–EGFP expression plasmid was constructed to constitutively express CPY–EGFP fusion protein,which contains six amino acids between CPY and EGFP,under A. oryzae pgkA promoter,which is a constitutively expressing strong promoter of 3-phosphoglycerate kinase gene。

我觉得好奇怪啊，为什么在CPY和EGFP之间加入6个氨基酸呢？而且这篇文章通篇也没写清楚到底这6个氨基酸是什么？
求做过相关研究的大神给与指导，不慎感激。
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1楼 2015-08-18 23:41:49
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半醒半梦

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zeroon: 金币+5, ★有帮助, 额，谢谢，可能懂了一些 2015-08-22 22:00:49
融合蛋白就是把你基因和GFP表达后融合在一起。我们这么亚细胞定位常做，很容易。
说白了就是有一个原核表达的空载，确定空载的GFP在多克隆位点的前边还是后边，如果GFP在多克隆位点的前边，那么在多克隆位点直接插入你目标基因（此处是你液泡羧肽酶基因，注意不要碱基移码）；如果GFP基因是在多克隆位点后边，那么把你目标基因去掉终止密码子插入多克隆位点（同上，注意插入位点到GFP起始密码子ATG，此段不要碱基移码），然后转染拟南芥染色质体或者基因枪洋葱表皮，就可以在共聚焦显微镜下观察了。
说了这么多，不知道你懂了没有。
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只要想起一生中后悔的事，梅花便落满了南山。
7楼2015-08-22 19:03:11
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ptttmt

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zeroon: 金币+1, 谢谢你的耐心回复，可是对我一点儿帮助也没有 2015-08-19 14:39:30
看看文献有没有引物序列啥的，6个氨基酸可能通过引物引入

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2楼2015-08-19 01:24:47
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ptttmt

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-08-22 23:04:48
你把文献全文仔细看看，刚才在pubmed上看文献有图谱，有table，应该可以推理出来6个氨基酸

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3楼2015-08-19 01:27:35
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zeroon

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ptttmt at 2015-08-19 01:27:35
你把文献全文仔细看看，刚才在pubmed上看文献有图谱，有table，应该可以推理出来6个氨基酸

对，氨基酸6个，也就18个碱基，很容易，在引物上添加就行了。但至于你说的文章有table，有图谱，那就不是了。我已经把文章吃了几遍了。没有！
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4楼2015-08-19 14:38:08
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zeroon

木虫 (正式写手)
5楼2015-08-19 16:37:33
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zeroon

木虫 (正式写手)
6楼2015-08-19 17:15:41
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zeroon

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 半醒半梦 at 2015-08-22 19:03:11
融合蛋白就是把你基因和GFP表达后融合在一起。我们这么亚细胞定位常做，很容易。
说白了就是有一个原核表达的空载，确定空载的GFP在多克隆位点的前边还是后边，如果GFP在多克隆位点的前边，那么在多克隆位点直接插 ...

你们做过液泡定位吗，还有用什么染料可以直接染色呢
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8楼2015-08-22 22:02:59
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半醒半梦

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zeroon at 2015-08-22 22:02:59
你们做过液泡定位吗，还有用什么染料可以直接染色呢...

我们这没做过液泡，核、内质网、细胞膜、叶绿体都做过，不过液泡没做过，内质网定位染料挺贵的，你可以问问试剂公司。使用染料，操作步骤一样。
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只要想起一生中后悔的事，梅花便落满了南山。
9楼2015-08-22 22:23:42
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赵zhao赵

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 半醒半梦 at 2015-08-22 19:03:11
融合蛋白就是把你基因和GFP表达后融合在一起。我们这么亚细胞定位常做，很容易。
说白了就是有一个原核表达的空载，确定空载的GFP在多克隆位点的前边还是后边，如果GFP在多克隆位点的前边，那么在多克隆位点直接插 ...

你好，我想请教下用RFP标记内质网  KDEL-RFP,RFP-KDEL或者 内质网信号肽-RFP-KDEL，这三种方式哪个可行呢
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10楼2019-04-25 15:18:59
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