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有关信号肽的很多疑惑 已有2人参与
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大家好，本人刚接触分子生物，很多基础的东西都不太明白，请各位大神赐教啊！ 就是我要把一个真核微生物的蛋白表达到酵母ppic9k这个质粒上去，因为我后续要研究这个蛋白的性质，所以想蛋白可以分泌至胞外，为了后续纯化方便，要利用His标签纯化蛋白。 1、现在ppic9k这个质粒上面有a分泌信号肽，但是我用网站分析了一下我的目的蛋白完整的CDS区域，发现它自身也有信号肽，结果是这样，我有点看不懂 # Measure Position Value Cutoff signal peptide? max. C 18 0.554 max. Y 18 0.685 max. S 1 0.922 mean S 1-17 0.824 D 1-17 0.760 0.450 YES Name=Sequence SP='YES' Cleavage site between pos. 17 and 18: VVA-QP D=0.760 D-cutoff=0.450 Networks=SignalP-noTM 然后我想问的是，他自身有信号肽的话，我想这个蛋白最后可以分泌至胞外，我是要利用它自身的信号肽分泌呢，还是利用ppic9k这个质粒上的a分泌信号肽呢？ 2、如果只能利用质粒上面的a分泌信号肽的话，是不是还要去除我的目的蛋白片段上面的信号肽序列呢？但是怎么去除呢？具体操作是依靠设计引物来做吗？ 3、我看很多文献上面都是采用的第一个酶切位点，这种选择是偶然的还是说一定要这么选的？是为了在用kex2酶切位点切掉a分泌信号肽之后可以少表达前面多出来的几个氨基酸序列吗？我如果选的是第二个酶切位点EcoR1和最后一个Not1可以吗？会对表达后的蛋白质的性质产生影响吗？ 跪求各位大神赐教啊！！！！！！ |
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 蛋白表达纯化鉴定精华 |
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8楼2016-01-04 16:30:46
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calorimetry
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2楼2015-06-02 12:57:53
lxj341401
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肉肉肉.: 金币+15 2015-06-02 17:16:40
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肉肉肉.: 金币+15 2015-06-02 17:16:40
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1、要在酵母中分泌表达的话，利用ppic9k这个质粒上的a分泌信号肽，而不是你目的蛋白本身带的信号肽，因为该信号肽酵母不一定识别。 2、去除你的目的蛋白片段上游的信号肽序列，因为这是成熟蛋白不需要的，具体方法就是你说的设计引物，从第18个氨基酸的编码序列开始扩增。 3、不一定要采用的第一个酶切位点，用后面的酶切位点对分泌表达没有影响，可能的影响就是N端多了几个氨基酸残基，具体对表达后的蛋白有没有影响，因不同的蛋白而异，没有规律，所以建议，做了再说。 |
3楼2015-06-02 17:09:57
4楼2015-06-02 17:16:30
luwei13566
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前两点楼上大神已经说的很清楚了，至于第三点我再稍微补充一下：蛋白因为连接原因导致在端部多出几个氨基酸目前一般认为和原始蛋白是一致的，测出来的性质也是可以被公认的。但不保证这些氨基酸一定不会对蛋白产生影响。一般表达的蛋白只要不出非常明显的问题，这个因素可以忽略，当然也和你研究目标相关！~ 如果你想用蛋白自带的信号肽也没有任何问题，把α信号肽替换掉，直接从ATG开始将你的全场基因连接上就可以。但是考虑到rbs、和kozak 序列的优化，去除α信号肽等问题，如果刚接触分子实验的话，建议还是用酵母α信号肽来做比较稳妥。 关于你说的那篇用自身信号肽进行分泌的文章，可否分享一下，我看看他是咋做的~ |
5楼2015-06-02 19:01:47
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http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00253-011-3246-y 这篇文章里面谈到成功分泌出来过哎大神！第18个氨基酸开始把他pcr出来的话，要加上ATG吗，好像不需要吧 |
6楼2015-06-02 19:08:26
luwei13566
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