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有关信号肽的很多疑惑 已有2人参与
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大家好，本人刚接触分子生物，很多基础的东西都不太明白，请各位大神赐教啊！ 就是我要把一个真核微生物的蛋白表达到酵母ppic9k这个质粒上去，因为我后续要研究这个蛋白的性质，所以想蛋白可以分泌至胞外，为了后续纯化方便，要利用His标签纯化蛋白。 1、现在ppic9k这个质粒上面有a分泌信号肽，但是我用网站分析了一下我的目的蛋白完整的CDS区域，发现它自身也有信号肽，结果是这样，我有点看不懂 # Measure Position Value Cutoff signal peptide? max. C 18 0.554 max. Y 18 0.685 max. S 1 0.922 mean S 1-17 0.824 D 1-17 0.760 0.450 YES Name=Sequence SP='YES' Cleavage site between pos. 17 and 18: VVA-QP D=0.760 D-cutoff=0.450 Networks=SignalP-noTM 然后我想问的是，他自身有信号肽的话，我想这个蛋白最后可以分泌至胞外，我是要利用它自身的信号肽分泌呢，还是利用ppic9k这个质粒上的a分泌信号肽呢？ 2、如果只能利用质粒上面的a分泌信号肽的话，是不是还要去除我的目的蛋白片段上面的信号肽序列呢？但是怎么去除呢？具体操作是依靠设计引物来做吗？ 3、我看很多文献上面都是采用的第一个酶切位点，这种选择是偶然的还是说一定要这么选的？是为了在用kex2酶切位点切掉a分泌信号肽之后可以少表达前面多出来的几个氨基酸序列吗？我如果选的是第二个酶切位点EcoR1和最后一个Not1可以吗？会对表达后的蛋白质的性质产生影响吗？ 跪求各位大神赐教啊！！！！！！ |
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9楼2016-01-04 22:37:24
calorimetry
铜虫 (正式写手)
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2楼2015-06-02 12:57:53
lxj341401
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
肉肉肉.: 金币+15 2015-06-02 17:16:40
感谢参与，应助指数 +1
肉肉肉.: 金币+15 2015-06-02 17:16:40
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1、要在酵母中分泌表达的话，利用ppic9k这个质粒上的a分泌信号肽，而不是你目的蛋白本身带的信号肽，因为该信号肽酵母不一定识别。 2、去除你的目的蛋白片段上游的信号肽序列，因为这是成熟蛋白不需要的，具体方法就是你说的设计引物，从第18个氨基酸的编码序列开始扩增。 3、不一定要采用的第一个酶切位点，用后面的酶切位点对分泌表达没有影响，可能的影响就是N端多了几个氨基酸残基，具体对表达后的蛋白有没有影响，因不同的蛋白而异，没有规律，所以建议，做了再说。 |
3楼2015-06-02 17:09:57
4楼2015-06-02 17:16:30
