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梅雪芳新虫 (小有名气)
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[交流]
原代肝细胞MTT实验
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最近在分离小鼠原代肝细胞做MTT，但是遇到一些问题，我的操作过程如下： 1、无菌获取乳鼠肝组织，剪碎至1mm3大小，4℃ DMEM清洗血 2、约2倍于肝组织体积的0.25%胰酶消化3min 3、DMEM-HG终止消化，离心，弃上清 4，加与胰酶同体积的0.1%的二型胶原酶，消化6min 5，DMEM-HG终止消化 6，静置，待组织块下沉，取出上清液，200目细胞筛过滤 7，滤液离心，弃上清 8，于沉淀中加入红细胞裂解液，裂解3min 9，DMEM-HG终止裂解，离心，弃上清 10，加DMEM-HG重悬，台盼蓝计数，细胞数约达到7次方个 11,96孔板铺板，每孔200uL，5*104个/孔 12，孵育12h后细胞贴壁良好，加5mg/ml MTT 20ul/孔 作用4h 13，弃上清，加150ul/孔 DMSO，振荡10min 14，使用490nm读数。 问题是，加入MTT作用4h以后，没有形成蓝紫色甲瓒结晶，显微镜下看，只有及少数细胞内形成了结晶，读数也只是0.1~0.3之间。 我考虑到的几点原因是： 1，细胞浓度太小。因为我咨询过做脾细胞相关实验的，说是把细胞浓度调到了6次方/孔 2，细胞活力不好。可是从贴壁性能来看，细胞活力应该也不会太差 3，细胞太杂，分离出来的时候明显有枯否细胞、成纤维细胞等 不知道有没有人做过相关实验，可以交流或指导  |
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2楼2015-10-29 11:49:07