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李小闹

新虫 (初入文坛)

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[求助] 嘌呤筛稳定株筛不出来怎么办

大家好，我最近用慢病毒转染的C3A细胞，嘌呤抗性，之前用梯度实验过浓度，1.5μg/ml可全部一周内杀死；感染3天后加嘌呤杀11天，未转染组全部死亡，带GFP的对照组部分死亡，多数表达GFP且细胞状态良好，目的基因组同样部分死亡后大部分生长正常（不带GFP），但用免疫荧光看结果只有少量细胞表达目的蛋白，western也没有目的条带。想请教大家如何将这些少数细胞筛出来，减少细胞密度加大嘌呤剂量可以吗？谢谢

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1楼 2015-05-18 10:29:16

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zhang201415

新虫 (初入文坛)

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4楼2015-05-18 14:20:28

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cckk_2000

金虫 (小有名气)

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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-05-19 08:37:38

我觉得既然对照组全部死亡，说明你的嘌呤霉素浓度是合适的，但是如果GFP组只是“多数表达GFP”的话，而且实验组只有少数细胞表达目的蛋白，还是说明质粒构建过程中，挑的单克隆有问题，致使混入了没有连接目的基因的空载体，所以使细胞具有了嘌呤抗性。因此建议重新挑单克隆，或者重新转化，虽然费事，但是后续没有问题。

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李小闹

科研炮灰

2楼2015-05-18 11:07:04

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李小闹

新虫 (初入文坛)

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引用回帖:

2楼: Originally posted by cckk_2000 at 2015-05-18 11:07:04
我觉得既然对照组全部死亡，说明你的嘌呤霉素浓度是合适的，但是如果GFP组只是“多数表达GFP”的话，而且实验组只有少数细胞表达目的蛋白，还是说明质粒构建过程中，挑的单克隆有问题，致使混入了没有连接目的基因的 ...

谢谢，但应该不是质粒的问题，因为我的空载是带GFP的，而目的细胞并没有表达GFP，我怀疑是到后期细胞有点密杀不动了，而当时对照组细胞已经死很多，没有那么密，不知道这个会不会影响

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3楼2015-05-18 12:07:01

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