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李小闹

新虫 (初入文坛)

[求助] 嘌呤筛稳定株筛不出来怎么办

大家好,我最近用慢病毒转染的C3A细胞,嘌呤抗性,之前用梯度实验过浓度,1.5μg/ml可全部一周内杀死;感染3天后加嘌呤杀11天,未转染组全部死亡,带GFP的对照组部分死亡,多数表达GFP且细胞状态良好,目的基因组同样部分死亡后大部分生长正常(不带GFP),但用免疫荧光看结果只有少量细胞表达目的蛋白,western也没有目的条带。想请教大家如何将这些少数细胞筛出来,减少细胞密度加大嘌呤剂量可以吗?谢谢
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cckk_2000

银虫 (小有名气)


kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-05-19 08:37:38
我觉得既然对照组全部死亡,说明你的嘌呤霉素浓度是合适的,但是如果GFP组只是“多数表达GFP”的话,而且实验组只有少数细胞表达目的蛋白,还是说明质粒构建过程中,挑的单克隆有问题,致使混入了没有连接目的基因的空载体,所以使细胞具有了嘌呤抗性。因此建议重新挑单克隆,或者重新转化,虽然费事,但是后续没有问题。

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科研炮灰
2楼2015-05-18 11:07:04
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李小闹

新虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by cckk_2000 at 2015-05-18 11:07:04
我觉得既然对照组全部死亡,说明你的嘌呤霉素浓度是合适的,但是如果GFP组只是“多数表达GFP”的话,而且实验组只有少数细胞表达目的蛋白,还是说明质粒构建过程中,挑的单克隆有问题,致使混入了没有连接目的基因的 ...

谢谢,但应该不是质粒的问题,因为我的空载是带GFP的,而目的细胞并没有表达GFP,我怀疑是到后期细胞有点密杀不动了,而当时对照组细胞已经死很多,没有那么密,不知道这个会不会影响

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2015-05-18 12:07:01
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zhang201415

新虫 (初入文坛)

本帖内容被屏蔽

4楼2015-05-18 14:20:28
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