| 查看: 2575 | 回复: 2 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
8.5kD小分子蛋白WB一直没出条带 已有2人参与
|
|||
|
目标蛋白加上flag标签有8.5kD左右。 首先表达载体是常见的pcDNA3.1，重组质粒经测序分析没有任何问题。 转染时用带EGFP的载体做对照，效率不高，20-30%左右。 SDS-PAGE分离胶浓度15%，浓缩胶5%，70-80V溴酚蓝带跑到分离胶1/4处，换110-120V跑到分离胶2/3处。 转膜用BIO-RAD的0.2um PVDF膜，天能的系统，湿转180mA 90min，也用过90V（电流200左右）60min。 有用预染marker，至少75kD的带可以完全转到膜上。5%脱脂奶粉（GenStar）封闭1h-2h。 anti-flag一抗1:1000-2000稀释，4度过夜，二抗2h。ECL发光。 曝光时间最长1000s，都是鬼都没看见。 孵过anti-EGFP的一抗，转染EGFP对照组出了很正常的条带，基本证实载体的表达和转染过程没问题。 以β-actin做内参，自动曝光0.5s就有条带。 然后目标蛋白一直没出来…… 更烦躁的是拿去另个实验室做，BIO-RAD系统，sigma抗体还是没有条带…… 求大神指条明路_(:з」∠)_ |
回复此楼» 猜你喜欢
售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急
已经有6人回复
-
明天应该可查了！？
已经有5人回复
-
如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》
已经有7人回复
-
没有任何消息-是不是就凉了
已经有8人回复
-
售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急
已经有3人回复
-
人气不行了
已经有10人回复
-
我面上完蛋了
已经有10人回复
-
能否退出参与的面上项目解除限项
已经有24人回复
-
filecode，4个jtjc了
已经有17人回复
-
2026国自然函评费到账
已经有19人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 求一分 蛋白质电泳详细过程 还有需要的溶液
已经有6人回复
- 最近做一个240KD大小蛋白mtor的WB，怎么都不出结果
已经有17人回复
- SDS-PAGE后，考染有条带，WB后检测不到目的蛋白。
已经有7人回复
- 170kDa膜蛋白MRP1跑WB遇到问题
已经有39人回复
- WB的肝组织蛋白提取
已经有3人回复
- WB检测蛋白表达量时关于上样量的问题？
已经有16人回复
- WB一抗二抗洗脱液洗脱后蛋白有耗损的问题怎么解决？
已经有4人回复
- WB中如何根据蛋白质的分子量来选择分离胶的浓度？
已经有12人回复
- 蛋白浓度过低，无法做WB,如何进行蛋白浓缩？
已经有18人回复
- 在做WB，想知道大概一般提取的蛋白浓度是多少？
已经有4人回复
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
本帖内容被屏蔽 |
3楼2015-08-16 00:59:39
2楼2015-08-16 00:27:13
