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8.5kD小分子蛋白WB一直没出条带 已有2人参与
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目标蛋白加上flag标签有8.5kD左右。 首先表达载体是常见的pcDNA3.1，重组质粒经测序分析没有任何问题。 转染时用带EGFP的载体做对照，效率不高，20-30%左右。 SDS-PAGE分离胶浓度15%，浓缩胶5%，70-80V溴酚蓝带跑到分离胶1/4处，换110-120V跑到分离胶2/3处。 转膜用BIO-RAD的0.2um PVDF膜，天能的系统，湿转180mA 90min，也用过90V（电流200左右）60min。 有用预染marker，至少75kD的带可以完全转到膜上。5%脱脂奶粉（GenStar）封闭1h-2h。 anti-flag一抗1:1000-2000稀释，4度过夜，二抗2h。ECL发光。 曝光时间最长1000s，都是鬼都没看见。 孵过anti-EGFP的一抗，转染EGFP对照组出了很正常的条带，基本证实载体的表达和转染过程没问题。 以β-actin做内参，自动曝光0.5s就有条带。 然后目标蛋白一直没出来…… 更烦躁的是拿去另个实验室做，BIO-RAD系统，sigma抗体还是没有条带…… 求大神指条明路_(:з」∠)_ |
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