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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 求蛋白保存的条件
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sxjcas

禁虫 (知名作家)
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1楼 2015-02-10 13:13:56
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九字江山

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
sxjcas: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-02-15 19:56:17
蛋白保存应根据对活性的要求及蛋白的种类而定：抗体:除非一些公司特别要求-20℃冻存，一般4℃可稳定一年（无菌，如加叠氮钠），因为抗体是一种具有非常稳定结构的蛋白；要求具有活性的蛋白,最好根据需要小量保存4℃(一周）、-20℃(一个月)、-80℃(六个月)、液氮（基本无限期），反复冻融会导致诸多不良后果，如聚集、修饰、降解、污染等（取决于蛋白浓度、缓冲液成分及蛋白本身的特点）；冻干是一种很好的长期保存法（如条件具备），在大多数情况下可以很好地保存蛋白的活性，但不适于某些蛋白（因有些蛋白对冻干重溶时必然产生的盐离子浓度的急剧变化反应不佳，其活性会永久丧失（应具体对待，尚无规律可循）。  另：蛋白聚集与二硫键形成是两个概念，巯基乙醇只负责维持-SH的游离状态，形成二硫键是一化学反应，产生纯净物，聚集一般只通过一些离子键、范德华力、疏水力形成，可以用物理方法分开。  较长时间的保存最好用DTT。在加入缓冲液中24小时内，巯基乙醇被氧化，其后可加速蛋白的失活，而DTT不危及蛋白质的巯基。因此，最好是在制备蛋白质样品的时候用大约12mmol/L巯基乙醇，而长期储存则使用1-5mmol/L的DTT。（见《蛋白质技术手册》）  另外，我有印象看产品目录的时候，看到有一种用于western的试剂盒，提供的试剂可以在还原二硫键之后在巯基上烷基化，这样就防止了二硫键的再次生成。  抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100Mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。        绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂

弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保存3-5年。         保存稀释后的单抗应加入0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存数月。        其他注意事项：        分装可以最大程度的降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。         复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在4℃，避免再冻起来！ 抗体工作液应该当天配制当天用完，在4℃ 尽量不要超过1天。绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。尽量将抗体保存在冰箱里层，而不是门上。      无论是保存还是运输，绝对避免反复冻融！反复冻融会导致抗体变性，导致多聚体形成，从而降低抗体的结合能力！        蛋白在高浓度时更不容易降解（1 mg/ml 或者更高），这就是为什么在抗体中加入BSA之类作为稳定剂的原因了；另一方面，加入的蛋白也可以减少抗体由于管壁吸附所造成的损失。但是如果抗体要用来标记的话，则不能加入蛋白稳定剂，因为这些稳定剂会和抗体一起竞争结合标记物。        为了防止微生物污染，叠氮化钠经常被加入到抗体中（终浓度0.02% (w/v)）。 叠氮化钠会干扰任何含有氨基基团的偶联，因此在进行偶联之前，应将叠氮化钠去除。偶联后的抗体可以加入叠氮化钠保存，但是浓度只能是0.01％。对于需要偶联的抗体，thimerosal (merthiolate)可以替代叠氮化钠作为保护剂！  注：叠氮化钠的去除方式：         可以通过凝胶电泳或过滤的方式去除！IgG的分子量是150kDa (IgM 是~ 600kDa); 叠氮化钠的分子量只有65Da。使用cut off 14kDa的滤膜即可将叠氮化钠从抗体中去除。        纯化IgG: 不要保存稀释的抗体,高浓度有利于保存。IgG会粘附于玻璃或塑料，低于0.1mg/ml的蛋白会很快被吸收并变性失去活性。
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2楼2015-02-15 10:07:19
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sxjcas

禁虫 (知名作家)
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