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落木778

铜虫 (小有名气)

[求助] 构建携带HA标签的基因 已有2人参与

各位，请求帮助，我需要在基因的3'端构建携带HA标签，需要将终止密码子从目的基因序列后面转移到融合标签基因序列后面。
这样做的方法是什么? 谢谢！！！
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1楼 2015-01-23 17:08:38
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
落木778(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-23 21:50:25
一般如果是HA标签在3‘端的质粒的话，它后面会自带终止密码子的不用另外加，在扩增自己基因的是候引物不带终止密码子就可以了，另外注意不要移码。
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2楼2015-01-23 18:21:31
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落木778

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hanxiaominhu at 2015-01-23 18:21:31
一般如果是HA标签在3‘端的质粒的话，它后面会自带终止密码子的不用另外加，在扩增自己基因的是候引物不带终止密码子就可以了，另外注意不要移码。

我打算设计携带HA-tag的引物，然后直接PCR扩增出目的基因-HA片段，这样的话就涉及终止密码子的问题了。谢谢！！！
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3楼2015-01-23 21:26:02
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
选好起始和终止，两外你的验证ha的表达
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落木778
4楼2015-01-23 21:31:05
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落木778

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by 红卫大兵 at 2015-01-23 21:31:05
选好起始和终止，两外你的验证ha的表达

你好，因为还没有做过这类实验，实在有太多的疑问了，好希望有位大神来帮我细细解答。引物设计是不是需要与HA标签序列完全匹配才能扩增出来？引物末端还需要加终止密码子不？这样设计是不是引物过长，导致Tm值过高？大神帮帮忙吧！
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5楼2015-01-23 22:43:54
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 落木778 at 2015-01-23 22:43:54
你好，因为还没有做过这类实验，实在有太多的疑问了，好希望有位大神来帮我细细解答。引物设计是不是需要与HA标签序列完全匹配才能扩增出来？引物末端还需要加终止密码子不？这样设计是不是引物过长，导致Tm值过高 ...

我最多在引物的5‘端另外加了20多个碱基，引物本身长20多，最后引物就有近50bp，是能P出来的，HA标签30多的话，可以试一试。另外Tm值的计算不是完全看引物长度的，要看与模板的配对程度。
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6楼2015-01-25 09:40:16
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落木778

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by hanxiaominhu at 2015-01-25 09:40:16
我最多在引物的5‘端另外加了20多个碱基，引物本身长20多，最后引物就有近50bp，是能P出来的，HA标签30多的话，可以试一试。另外Tm值的计算不是完全看引物长度的，要看与模板的配对程度。...

谢谢！
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7楼2015-01-25 15:33:15
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sll907519257

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by hanxiaominhu at 2015-01-25 09:40:16
我最多在引物的5‘端另外加了20多个碱基，引物本身长20多，最后引物就有近50bp，是能P出来的，HA标签30多的话，可以试一试。另外Tm值的计算不是完全看引物长度的，要看与模板的配对程度。...

HA标签不是只有1kd吗

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8楼2017-10-28 09:30:32
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by sll907519257 at 2017-10-28 09:30:32
HA标签不是只有1kd吗
...

HA标签很短的，你可以查一下。

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9楼2017-10-28 09:45:36
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by sll907519257 at 2017-10-28 09:30:32
HA标签不是只有1kd吗
...

应该是30多bp。

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10楼2017-10-28 09:46:22
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