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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于 提取巨噬细胞蛋白问题
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searush

铜虫 (初入文坛)

[求助] 关于 提取巨噬细胞蛋白问题 已有2人参与

请问下怎么提取巨噬细胞蛋白做WB，我之前是六孔板各加250微升的RIPA，浓度测定为2-4 ug/ul。请问这样做WB可以吗？还有裂解液用RIPA合适吗，还是有专门的细胞蛋白裂解液吗？  请指教
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学术研究
1楼 2015-01-22 11:18:08
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回帖置顶 ( 共有1个 )

searush

铜虫 (初入文坛)
searush: 回帖置顶 2015-01-27 10:55:22
各位大虫们  解答下哦
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学术研究
2楼2015-01-22 11:18:53
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普通回帖

searush

铜虫 (初入文坛)
哎 怎么没人解答啊
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学术研究
3楼2015-01-27 10:56:52
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笑语盈盈

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我也是做巨噬细胞的WB，不知道楼主的问题解决了吗？
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4楼2015-04-08 09:37:27
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searush

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 笑语盈盈 at 2015-04-08 09:37:27
我也是做巨噬细胞的WB，不知道楼主的问题解决了吗？

其实细胞实验 所提的蛋白大概就那样  可以使用的   
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学术研究
5楼2015-05-04 16:46:07
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779233023

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我最近也在从巨噬细胞中提取蛋白，但是浓度远比楼主的低，不知道楼主是怎么做到的，方便说一下么。
我先说说我是怎么做的：
先是铺板后给药，提蛋白前细胞已经特别密集的分布到六孔板中有些甚至叠起来。
1.细胞用培养基吹打下来，收集细胞悬液1000rpm离心5分钟。
2.用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3.每孔加入150μl RIPA裂解液（临用前加入PMSF，终浓度为1mM）混匀，转入96孔板中4℃震荡30分钟。
4.14000rpm离心10分钟。将上清快速吸入预冷的干净EP管中（注意不要吸到沉淀）。
5.BCA测定蛋白浓度。
我这样提取出来的浓度最大也就0.8mg/ml,后来每孔加100ul的 RIPA裂解液甚至两个孔加100ul的RIPA裂解液浓度也一直上不来。不知道是什么原因，都快要愁死了。。。RIPA裂解液我是用的碧云天的 P0013B，强的裂解液。
求楼主指点一下。。。。
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6楼2016-01-08 18:43:04
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