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关于 提取巨噬细胞蛋白问题 已有2人参与
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请问下怎么提取巨噬细胞蛋白做WB，我之前是六孔板各加250微升的RIPA，浓度测定为2-4 ug/ul。请问这样做WB可以吗？还有裂解液用RIPA合适吗，还是有专门的细胞蛋白裂解液吗？ 请指教 |
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2楼2015-01-22 11:18:53
3楼2015-01-27 10:56:52
4楼2015-04-08 09:37:27
5楼2015-05-04 16:46:07
【答案】应助回帖
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我最近也在从巨噬细胞中提取蛋白，但是浓度远比楼主的低，不知道楼主是怎么做到的，方便说一下么。 我先说说我是怎么做的： 先是铺板后给药，提蛋白前细胞已经特别密集的分布到六孔板中有些甚至叠起来。 1.细胞用培养基吹打下来，收集细胞悬液1000rpm离心5分钟。 2.用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次洗涤后尽可能吸干上清。 3.每孔加入150μl RIPA裂解液（临用前加入PMSF，终浓度为1mM）混匀，转入96孔板中4℃震荡30分钟。 4.14000rpm离心10分钟。将上清快速吸入预冷的干净EP管中（注意不要吸到沉淀）。 5.BCA测定蛋白浓度。 我这样提取出来的浓度最大也就0.8mg/ml,后来每孔加100ul的 RIPA裂解液甚至两个孔加100ul的RIPA裂解液浓度也一直上不来。不知道是什么原因，都快要愁死了。。。RIPA裂解液我是用的碧云天的 P0013B，强的裂解液。 求楼主指点一下。。。。 |
6楼2016-01-08 18:43:04
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