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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 我的cDNA.你在哪，怎么千呼万唤不出来
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涅槃之曦

铁虫 (正式写手)

[求助] 我的cDNA.你在哪，怎么千呼万唤不出来 已有5人参与

用玉米幼苗提的RNA,反转录成CDNA.跑PCR一直没有条带，换了酶和温度梯度，还是不得行！恳求各位大师指点，小女子在此跪谢了。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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1楼 2015-01-15 23:38:26
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

biot

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
涅槃之曦(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-01-16 17:32:10
玉米的应该非常好做啊，是不是RNA提取的有问题，跑电泳没有？
RNA没问题的话按照程序直接反转录，当然要保证反转录没问题，反转录为cDNA在4度冰箱中放一个月都可以用，-20的可以放更久啊！
建议从源头上检查原因，或者重提RNA。
我前两周做玉米的，结果很好，做的也很顺利。
祝你实验成功！
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扬帆起航！
14楼2015-01-16 16:30:06
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涅槃之曦

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 1009238055 at 2015-01-16 20:35:26
刚刚想错了，以为你送CDNA去测序呢。那会不会是你的片段太长了哦，长片段的话，使用LA Taq酶效果会好很多哦。建议用其他的引物做个阳性对照验证一下你的模板和PCR的其他试剂。如果模板没有问题，用TOUCH DOWN PCR程 ...

都试了，还是跑不出来

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19楼2015-01-16 21:04:43
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普通回帖

晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-17 19:48:43
看来做玉米遇到难题的真不少啊。请问你的cDNA质量如何？有用Actin检测一下吗？如果cDNA质量好，那就需要优化体系去扩增你需要的目的基因了。
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2楼2015-01-16 08:34:00
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
涅槃之曦(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-16 17:31:23
得到cDNA之后是否在短时间内就进行PCR了呢？如果酶和温度都尝试过的话，确认模板是否降解了，引物设计的是否合理。（反转录时的反转录酶也很重要的）
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
3楼2015-01-16 09:07:14
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涅槃之曦

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-01-16 08:34:00
看来做玉米遇到难题的真不少啊。请问你的cDNA质量如何？有用Actin检测一下吗？如果cDNA质量好，那就需要优化体系去扩增你需要的目的基因了。

CDNA质量还可以，元旦节提的，难道是降解了

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4楼2015-01-16 09:44:21
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涅槃之曦

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-01-16 09:07:14
得到cDNA之后是否在短时间内就进行PCR了呢？如果酶和温度都尝试过的话，确认模板是否降解了，引物设计的是否合理。（反转录时的反转录酶也很重要的）

反转录时用的是Takara的试剂盒，做定量反转录的

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5楼2015-01-16 09:45:30
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快乐农夫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
涅槃之曦(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-16 17:31:39
跑内参了吗？cDNA一般不太容易降解的，我13年九月份反转录的昨天还拿来扩基因，一点问题没有。这个一般出问题主要出在提RNA的环节上
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6楼2015-01-16 09:52:37
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晞朔

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 涅槃之曦 at 2015-01-16 09:44:21
CDNA质量还可以，元旦节提的，难道是降解了
...

如果cDNA没问题，建议优化PCR体系吧。
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7楼2015-01-16 10:39:32
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 涅槃之曦 at 2015-01-16 09:45:30
反转录时用的是Takara的试剂盒，做定量反转录的
...

元旦节提的cDNA？，这都十几天啦，模板降解了，怪不得P不出条带了。
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
8楼2015-01-16 11:32:56
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涅槃之曦

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 快乐农夫 at 2015-01-16 09:52:37
跑内参了吗？cDNA一般不太容易降解的，我13年九月份反转录的昨天还拿来扩基因，一点问题没有。这个一般出问题主要出在提RNA的环节上

没有跑内参

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9楼2015-01-16 12:40:03
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涅槃之曦

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-01-16 11:32:56
元旦节提的cDNA？，这都十几天啦，模板降解了，怪不得P不出条带了。...

焦虑

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10楼2015-01-16 12:40:32
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