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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 我的cDNA.你在哪，怎么千呼万唤不出来
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涅槃之曦

铁虫 (正式写手)
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7楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-01-16 10:39:32
如果cDNA没问题，建议优化PCR体系吧。...

不懂，

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11楼2015-01-16 12:40:46
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晞朔

金虫 (正式写手)
★
涅槃之曦(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-16 17:31:57
引用回帖:
11楼: Originally posted by 涅槃之曦 at 2015-01-16 12:40:46
不懂，
...

PCR也就反应体系和反应程序两块内容。反应体系关键的两部分是酶（+buffer）和模板。模板没有问题，你可以试试不同的酶，这个得看你的要求了。比如，你需要高保真，比如你的目的基因需要GC优化。第二个部分就是反应程序，涉及到退火温度，延伸时间等几个因素。
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12楼2015-01-16 13:44:50
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涅槃之曦

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-01-16 13:44:50
PCR也就反应体系和反应程序两块内容。反应体系关键的两部分是酶（+buffer）和模板。模板没有问题，你可以试试不同的酶，这个得看你的要求了。比如，你需要高保真，比如你的目的基因需要GC优化。第二个部分就是反应 ...

好的，谢谢

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13楼2015-01-16 14:55:37
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biot

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
涅槃之曦(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-01-16 17:32:10
玉米的应该非常好做啊，是不是RNA提取的有问题，跑电泳没有？
RNA没问题的话按照程序直接反转录，当然要保证反转录没问题，反转录为cDNA在4度冰箱中放一个月都可以用，-20的可以放更久啊！
建议从源头上检查原因，或者重提RNA。
我前两周做玉米的，结果很好，做的也很顺利。
祝你实验成功！
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扬帆起航！
14楼2015-01-16 16:30:06
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1009238055

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
涅槃之曦(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-16 17:32:19
你看一下预测的CDNA片段是不是高GC的，如果高GC,很难扩增的。自己比对一下看引物有没有在内含子里面哦
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15楼2015-01-16 16:50:28
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涅槃之曦

铁虫 (正式写手)
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15楼: Originally posted by 1009238055 at 2015-01-16 16:50:28
你看一下预测的CDNA片段是不是高GC的，如果高GC,很难扩增的。自己比对一下看引物有没有在内含子里面哦

GC含量不高，cDNA里面没有内含子吧

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16楼2015-01-16 17:33:57
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涅槃之曦

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by biot at 2015-01-16 16:30:06
玉米的应该非常好做啊，是不是RNA提取的有问题，跑电泳没有？
RNA没问题的话按照程序直接反转录，当然要保证反转录没问题，反转录为cDNA在4度冰箱中放一个月都可以用，-20的可以放更久啊！
建议从源头上检查原因， ...

真的吗？谢谢你

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17楼2015-01-16 17:36:47
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1009238055

金虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 涅槃之曦 at 2015-01-16 17:33:57
GC含量不高，cDNA里面没有内含子吧
...

刚刚想错了，以为你送CDNA去测序呢。那会不会是你的片段太长了哦，长片段的话，使用LA Taq酶效果会好很多哦。建议用其他的引物做个阳性对照验证一下你的模板和PCR的其他试剂。如果模板没有问题，用TOUCH DOWN PCR程序跑一下PCR，这种方法一般都比较靠谱的。如果这样还是不能扩增出来的话，可能就是玉米基因组测序的时候这个基因没有问题啦。
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18楼2015-01-16 20:35:26
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涅槃之曦

铁虫 (正式写手)
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18楼: Originally posted by 1009238055 at 2015-01-16 20:35:26
刚刚想错了，以为你送CDNA去测序呢。那会不会是你的片段太长了哦，长片段的话，使用LA Taq酶效果会好很多哦。建议用其他的引物做个阳性对照验证一下你的模板和PCR的其他试剂。如果模板没有问题，用TOUCH DOWN PCR程 ...

都试了，还是跑不出来

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19楼2015-01-16 21:04:43
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1009238055

金虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by 涅槃之曦 at 2015-01-16 21:04:43
都试了，还是跑不出来
...

阳性对照也没有？那就是你模板的问题啦。如果阳性对照有，建议验证一下引物，PCR一般情况都很好跑的，如果这样的话，一定是有一些我们没有注意到的小细节出错了。如果引物没有问题，你可以做温度梯度去优化一下PCR体系哈。
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20楼2015-01-16 21:32:54
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