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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 实验技术 » 提取植物RNA时枪头等需不需要用DEPC水处理
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a71840584

金虫 (正式写手)

[求助] 提取植物RNA时枪头等需不需要用DEPC水处理 已有1人参与

准备研究经过染毒处理后的植物叶片中某种酶基因表达量的变化，打算这样做：先提取新鲜植物材料（蚕豆）叶片中的RNA，然后反转录cDNA，再去荧光定量。由于没做过这方面实验，好多不懂的地方，想请教一下高手一些问题。
1. 提RNA前所有的耗材怎么处理呀，新鲜的植物组织是不是必须用液氮研磨？用到的枪头离心管到底需不需要用0.1%DEPC水处理？DEPC好像吸入毒性挺大的还致癌什么的怪吓人。。。用到的玻璃器皿也需要DEPC水浸泡吗？我提RNA用的是试剂盒，上面注意事项上只说：玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。没提到DEPC处理的事。
2. 因为我刚做怕提的RNA质量不好不敢反转录，所以想先跑下电泳看看。我是这么做的把提取的RNA样品取10μl, 用RNase-Free Water（试剂盒自带）稀释到100μl,其余先放入-20冰箱，我想问上样的时候加多少μl的RNA样品和多少μl的loding buffer好？这个loding buffer用跑DNA电泳的可以吗？电泳缓冲液用1*TAE可以吗，需要DEPC处理吗？
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再牛逼的肖邦也弹不出哥的忧伤。。。
1楼 2015-01-14 17:05:46
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starseacow

专家顾问 (职业作家)
★ ★ ★
q317476148: 金币+3 2015-01-15 18:24:14
好像很久没见你发帖了，实验进展如何？

1 植物组织最好液氮研磨。所有实验器具需要DEPC处理，不过不用太担心，注意保护自己就好。枪头如果买进口的无RNase污染的，可以直接用，国产的还是DEPC处理一下比较放心。我的经验，不太注意的话，RNA很可能降解。试剂盒上写的方法可以试试，不过我自己倾向于用DEPC。
2 Loading buffer的使用参考其具体说明书。单纯看提取RNA质量，认真清洗好电泳槽，使用新配置的TAE和胶，不需要DEPC处理。
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a71840584
植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
2楼2015-01-14 17:31:41
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sicilia189

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
a71840584(q317476148代发): 金币+2 2015-01-15 18:24:26
a71840584: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-01-16 11:30:17
1 植物组织需用液氮研磨，因要保持低温；枪头、离心管等不需DEPC处理，120℃高温灭菌40分钟，60℃烘干即可，但最好分出专门用于RNA操作的枪头、离心管，不与DNA耗材混用；

2 RNA稀释后，上样时加0.5-1μg左右即可，样品量过多易过载，loding buffer按DNA用量即可，loding buffer和电泳用品最好DNA、RNA区分开，但用法和用量相同。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2015-01-15 00:00:13
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a71840584

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2015-01-14 17:31:41
好像很久没见你发帖了，实验进展如何？

1 植物组织最好液氮研磨。所有实验器具需要DEPC处理，不过不用太担心，注意保护自己就好。枪头如果买进口的无RNase污染的，可以直接用，国产的还是DEPC处理一下比较放心。 ...

谢谢高手的关心和回答。最近生理生化的东西做着都没意思啦，发了几篇文章基本够毕业的了。现在没事开始做分子方面的了，还打算做些电镜实验。也是都不会，正在研究中。还请高手不吝赐教呀，嘿嘿，先谢啦！
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再牛逼的肖邦也弹不出哥的忧伤。。。
4楼2015-01-15 15:56:58
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a71840584

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by sicilia189 at 2015-01-15 00:00:13
1 植物组织需用液氮研磨，因要保持低温；枪头、离心管等不需DEPC处理，120℃高温灭菌40分钟，60℃烘干即可，但最好分出专门用于RNA操作的枪头、离心管，不与DNA耗材混用；

2 RNA稀释后，上样时加0.5-1μg左右即可 ...

谢谢哈，今天第一次提RNA，提的倒是挺快，前后不到1小时就完了，不过液氮磨完转移到离心管的时候感觉植物组织就有点变软，跑完电泳看着一片白。。分不清啥28S和18S的，估计是降解了。。明天严格处理下再提一次试试吧。。
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再牛逼的肖邦也弹不出哥的忧伤。。。
5楼2015-01-15 16:02:04
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starseacow

专家顾问 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by a71840584 at 2015-01-15 15:56:58
谢谢高手的关心和回答。最近生理生化的东西做着都没意思啦，发了几篇文章基本够毕业的了。现在没事开始做分子方面的了，还打算做些电镜实验。也是都不会，正在研究中。还请高手不吝赐教呀，嘿嘿，先谢啦！...

这样很不错啊。很快毕业了吗？
印象里小木虫上有一个做植物RTPCR的方法帖子，你可以参考看看。
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
6楼2015-01-15 19:52:06
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cannon_2008

新虫 (初入文坛)
可以 试试天恩泽的RNA 固相清除剂，方便，枪头还是和离心管最好还是用进口小包装的，减少污染。
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Gooddesign,goodresearch,goodexpression,goodcommunicationinlab
7楼2015-02-04 16:27:07
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