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提取植物RNA时枪头等需不需要用DEPC水处理 已有1人参与
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准备研究经过染毒处理后的植物叶片中某种酶基因表达量的变化，打算这样做：先提取新鲜植物材料（蚕豆）叶片中的RNA，然后反转录cDNA，再去荧光定量。由于没做过这方面实验，好多不懂的地方，想请教一下高手一些问题。 1. 提RNA前所有的耗材怎么处理呀，新鲜的植物组织是不是必须用液氮研磨？用到的枪头离心管到底需不需要用0.1%DEPC水处理？DEPC好像吸入毒性挺大的还致癌什么的怪吓人。。。用到的玻璃器皿也需要DEPC水浸泡吗？我提RNA用的是试剂盒，上面注意事项上只说：玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。没提到DEPC处理的事。 2. 因为我刚做怕提的RNA质量不好不敢反转录，所以想先跑下电泳看看。我是这么做的把提取的RNA样品取10μl, 用RNase-Free Water（试剂盒自带）稀释到100μl,其余先放入-20冰箱，我想问上样的时候加多少μl的RNA样品和多少μl的loding buffer好？这个loding buffer用跑DNA电泳的可以吗？电泳缓冲液用1*TAE可以吗，需要DEPC处理吗？ |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
a71840584(q317476148代发): 金币+2 2015-01-15 18:24:26
a71840584: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-01-16 11:30:17
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a71840584(q317476148代发): 金币+2 2015-01-15 18:24:26
a71840584: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-01-16 11:30:17
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1 植物组织需用液氮研磨，因要保持低温；枪头、离心管等不需DEPC处理，120℃高温灭菌40分钟，60℃烘干即可，但最好分出专门用于RNA操作的枪头、离心管，不与DNA耗材混用； 2 RNA稀释后，上样时加0.5-1μg左右即可，样品量过多易过载，loding buffer按DNA用量即可，loding buffer和电泳用品最好DNA、RNA区分开，但用法和用量相同。 [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] |
3楼2015-01-15 00:00:13
starseacow
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q317476148: 金币+3 2015-01-15 18:24:14
q317476148: 金币+3 2015-01-15 18:24:14
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好像很久没见你发帖了，实验进展如何？ 1 植物组织最好液氮研磨。所有实验器具需要DEPC处理，不过不用太担心，注意保护自己就好。枪头如果买进口的无RNase污染的，可以直接用，国产的还是DEPC处理一下比较放心。我的经验，不太注意的话，RNA很可能降解。试剂盒上写的方法可以试试，不过我自己倾向于用DEPC。 2 Loading buffer的使用参考其具体说明书。单纯看提取RNA质量，认真清洗好电泳槽，使用新配置的TAE和胶，不需要DEPC处理。 |
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a718405842楼2015-01-14 17:31:41
4楼2015-01-15 15:56:58
5楼2015-01-15 16:02:04
