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amnewry

新虫 (初入文坛)

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专业: 农业昆虫学

[求助] pMT-bip-GFP转染S2细胞未见表达已有1人参与

最近在做果蝇的诱导表达系统，无法检测到蛋白的表达。
Axygen的质粒抽提试剂盒抽提pIEX-1-GFP和pMT-Bip-GFP的质粒，浓度约为500ng/ul左右。
使用cellfectin II和Qiagen的effectence同时对pMT-bi-GFP和pIEX-1-GFP进行了转染，转染前一天将细胞稀释至1*10^6 cell/ml。转染结果表明，cellfecin II和effectence都能成功转染pIEX-1-GFP，虽然转染效率不高（~20%），但有发荧光的细胞。
转染一天后，对转染pMT-bi-GFP的细胞加入10ul 100mM的CuSO4溶液至2ml培养基，至终浓度为500uM。
100mM CuSO4的配制为，0.25g溶解到10mL的双蒸水。硫酸铜用的是 sigma C8027 ，http://www.sigmaaldrich.com/cata ... h&region=CN
1d后未见发荧光细胞，直至4d后也未见荧光细胞后培养基荧光亮度增强（相对于对照）。收集上清和细胞，上清加入merk 的4*binding buffer至1*，纯化洗脱后，跑胶。抗his标签的单抗，western检测也未见条带，遗憾的是未做阳性对照。
对pMT-bip-GFP用测序引物测序，测序结果如下：
cgagagcatctggccaatgtgcatcagttgtggtcagcagcaaaatcaagtgaatcatctcagtgcaactaaagggggga
tccgatctcaatatgaagttatgcatattactggccgtcgtggcctttgttggcctctcgctcgggagatctccatggcc
cggggtaccggtagaaaaaatggctagcaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatg
gtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgctacatacggaaagcttacccttaaattt
atttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcactactttctcttatggtgttcaatgcttttcccg
ttatccggatcatatgaaacggcatgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaacgcactatatctt
tcaaagatgacgggaactacaagacgcgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatcgtatcgagttaaaa
ggtattgattttaaagaagatggaaacattctcggacacaaactcgagtacaactataactcacacaatgtatacatcac
ggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagctaacttcaaaattcgccacaacattgaagatggatccgttcaactagcag
accattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtcgacacaatctgcc
ctttcgaaagatcccaacgaaaagcgtgaccacatggtccttcttgagtttgtaactgctgctgggattacacatggcat
ggatgatccagcacagtggcggccgctcgagtctagagggcccttcgaaggtaagcctatccctaaccctctcctcggtc
tcgattctacgcgtaccggtcatcatcaccatcaccattgagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctaag
gcctgagctcgctgatcagcctcgatcgaggatccagacatgatagatac
和公布的序列有一个碱基的差异，但翻译结果没有受到影响。
另一点是，pIEX-1-GFP中的GFP和pMT-bip-GFP里的不一样，pMT-bip-GFP是Cycle 3-GFP,pIEX-1-GFP里的是eGFP，序列为：
MAHHHHHHHHHHSSGKETAAAKFERQHMDSPPPSGLVPRGSAGSGTIDDDDKSPMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGH
KFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGN
YKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQN
TPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK.
显微镜的型号是Nikon DS-Ri1
光栅是
EX 450-490
DM 505
BA 520
只有这么多金币了

~愿散尽赞个人品……请过路的各位兄弟姐妹帮忙解救~！不甚感激~！