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pMT-bip-GFP转染S2细胞未见表达 已有1人参与
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最近在做果蝇的诱导表达系统，无法检测到蛋白的表达。 Axygen的质粒抽提试剂盒抽提pIEX-1-GFP和pMT-Bip-GFP的质粒，浓度约为500ng/ul左右。 使用cellfectin II和Qiagen的effectence同时对pMT-bi-GFP和pIEX-1-GFP进行了转染，转染前一天将细胞稀释至1*10^6 cell/ml。转染结果表明，cellfecin II和effectence都能成功转染pIEX-1-GFP，虽然转染效率不高（~20%），但有发荧光的细胞。 转染一天后，对转染pMT-bi-GFP的细胞加入10ul 100mM的CuSO4溶液至2ml培养基，至终浓度为500uM。 100mM CuSO4的配制为，0.25g溶解到10mL的双蒸水。硫酸铜用的是 sigma C8027 ，http://www.sigmaaldrich.com/cata ... h®ion=CN 1d后未见发荧光细胞，直至4d后也未见荧光细胞后培养基荧光亮度增强（相对于对照）。收集上清和细胞，上清加入merk 的4*binding buffer至1*，纯化洗脱后，跑胶。抗his标签的单抗，western检测也未见条带，遗憾的是未做阳性对照。 对pMT-bip-GFP用测序引物测序，测序结果如下： cgagagcatctggccaatgtgcatcagttgtggtcagcagcaaaatcaagtgaatcatctcagtgcaactaaagggggga tccgatctcaatatgaagttatgcatattactggccgtcgtggcctttgttggcctctcgctcgggagatctccatggcc cggggtaccggtagaaaaaatggctagcaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatg gtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgctacatacggaaagcttacccttaaattt atttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcactactttctcttatggtgttcaatgcttttcccg ttatccggatcatatgaaacggcatgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaacgcactatatctt tcaaagatgacgggaactacaagacgcgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatcgtatcgagttaaaa ggtattgattttaaagaagatggaaacattctcggacacaaactcgagtacaactataactcacacaatgtatacatcac ggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagctaacttcaaaattcgccacaacattgaagatggatccgttcaactagcag accattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtcgacacaatctgcc ctttcgaaagatcccaacgaaaagcgtgaccacatggtccttcttgagtttgtaactgctgctgggattacacatggcat ggatgatccagcacagtggcggccgctcgagtctagagggcccttcgaaggtaagcctatccctaaccctctcctcggtc tcgattctacgcgtaccggtcatcatcaccatcaccattgagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctaag gcctgagctcgctgatcagcctcgatcgaggatccagacatgatagatac 和公布的序列有一个碱基的差异，但翻译结果没有受到影响。 另一点是，pIEX-1-GFP中的GFP和pMT-bip-GFP里的不一样，pMT-bip-GFP是Cycle 3-GFP,pIEX-1-GFP里的是eGFP，序列为： MAHHHHHHHHHHSSGKETAAAKFERQHMDSPPPSGLVPRGSAGSGTIDDDDKSPMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGH KFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGN YKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQN TPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK. 显微镜的型号是Nikon DS-Ri1 光栅是 EX 450-490 DM 505 BA 520 只有这么多金币了  ~愿散尽赞个人品……请过路的各位兄弟姐妹帮忙解救~！不甚感激~！ |
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2楼2015-01-08 14:05:27
3楼2015-01-09 23:19:48
| 祝福。 |
4楼2015-02-04 11:04:48
5楼2015-06-16 17:23:30
eric9908
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