| 查看: 4237 | 回复: 3 | |||
[求助]
pet28a 和pet32a 连接701bp的目的片段后跑电泳图有杂带 ，求分析 已有1人参与
|
|
将pet28a和pet32a空质粒与目的条带用相同的酶双酶切后连接，转化至DH5α中，菌液PCR有条带，提质粒后已送测序，等待结果中，将质粒又转化至BL21（DE3）中，挑8个单克隆做菌液PCR有条带，很亮，再从BL21中提质粒pet28a-701， pet32a-701 跑电泳发现有杂带，而之前从DH5α中提质粒未见杂带，在BL21中提质粒跑电泳却又杂带， pet28a 空质粒5369bp，pet32a空质粒5900bp 目的条带701bp ，第一个图如图 lane1：15000marker 从上至下为15000,10000,7500，5000,2500,1000,250 bp； Lane2 ：pet28a 空质粒；Lane3：pet28a-701；Lane4：pet32a-701；Lane5：pet28a-701；Lane：pet32a-701；Lane：pet28a-701；Lane8： pet32a-701 Lane 3-8为挑的不同的单菌落， 我问了一个博士，他说连接过程中可以是多种的构象，有杂带是正常的，Lane 3-8 每个Lane有三个条带，最小的条带是最符合的，但其他两条条带是排列构象不同而已，可以认为都连接上了，我要做做双酶切的图，把701bp目的片段切下来，他说双酶切后条带就都一样了，这种说法合理吗？我就纳闷为什么在DH5α中提出来的重组质粒却没有杂带呢？难道是污染了？  C7G1TCW[SF58G(2C}J`[8EV.png 第二个图 Lane1 15000marker；Lane2：从DH5α中提质粒Pet28a-701； Lane3 ：pet28a 空质粒；Lane4：从DH5α中提质粒Pet32a-701；Lane5：pet32a空质粒；Lane6:1Kb Ladder marker  UWXKV~715_{QEY(]MYZ(5FV.jpg 第三个图将pet28a-701和pet32a-701重组质粒转化至BL21后做的菌液PCR Lane1：2000marker；Lane2-5菌液PCR正确701bp（含有pet28a-701菌液中），Lane6：没加样；Lane：7-10 均为菌液PCR正确701bp（含有pet32a-701菌液中）  )2N@DJIE$S2X0O@N{9L@]0E.jpg |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有295人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有6人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 表达载体质粒图谱（pQE30,pET32a+,pET21a,pET28a+,pET3a+, pGEX系列）
已经有116人回复
- pET28a双酶切后连接目的基因，什么也不长。。。
已经有23人回复
- pET28a与目的基因连接后转化长满菌
已经有9人回复
- 求指点用IPTG诱连接在pET28a上的蛋白表达
已经有13人回复
- 请问用Vector NTI如何实现在pET28a中加入目的基因片段的谱图绘制。
已经有10人回复
- 【求助/交流】（引物设计）怎么防止pET28a中Nco1的ATG影响目的基因的表达？
已经有9人回复
781055707
木虫 (著名写手)
- 应助: 291 (大学生)
- 金币: 3118.2
- 散金: 46
- 红花: 19
- 帖子: 2030
- 在线: 579.3小时
- 虫号: 3046113
- 注册: 2014-03-13
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
95846713: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2015-01-09 12:33:19
感谢参与，应助指数 +1
95846713: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2015-01-09 12:33:19
BL21（DE3）是蛋白表达型菌株，和DH5A不能比的，BL21（DE3）在用碱提法时我就常是两条带。楼主有三条带，最下面的是质粒双链断裂，线性化的质粒才和你的空载差不多，第二条是质粒单链断裂，第三条是环状质粒。你的博士朋友说的很对，它们都是一个质粒，被酶切以后，就线性化了，条带当然就一样了。楼主有PET28A,32A的空载的话，我们以后可以交换这些实验试剂呀 不过楼主的空载跑到了4500，换个marker 试试吧。 |
2楼2015-01-06 11:39:23
3楼2015-01-06 20:32:50
|
你好 我想问一下 我的是pet21载体连接的目的片段 都用然后用的DH5a感受态细胞 然后提出来的质粒 然后用双酶切鉴定 后发现 两条带一条5000一条3000bp 但是我的目的条带应该是600 但是没有带 是不是不对呀 发自小木虫IOS客户端 |
4楼2016-01-04 16:12:49
