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pet28a 和pet32a 连接701bp的目的片段后跑电泳图有杂带 ，求分析 已有1人参与
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将pet28a和pet32a空质粒与目的条带用相同的酶双酶切后连接，转化至DH5α中，菌液PCR有条带，提质粒后已送测序，等待结果中，将质粒又转化至BL21（DE3）中，挑8个单克隆做菌液PCR有条带，很亮，再从BL21中提质粒pet28a-701， pet32a-701 跑电泳发现有杂带，而之前从DH5α中提质粒未见杂带，在BL21中提质粒跑电泳却又杂带， pet28a 空质粒5369bp，pet32a空质粒5900bp 目的条带701bp ，第一个图如图 lane1：15000marker 从上至下为15000,10000,7500，5000,2500,1000,250 bp； Lane2 ：pet28a 空质粒；Lane3：pet28a-701；Lane4：pet32a-701；Lane5：pet28a-701；Lane：pet32a-701；Lane：pet28a-701；Lane8： pet32a-701 Lane 3-8为挑的不同的单菌落， 我问了一个博士，他说连接过程中可以是多种的构象，有杂带是正常的，Lane 3-8 每个Lane有三个条带，最小的条带是最符合的，但其他两条条带是排列构象不同而已，可以认为都连接上了，我要做做双酶切的图，把701bp目的片段切下来，他说双酶切后条带就都一样了，这种说法合理吗？我就纳闷为什么在DH5α中提出来的重组质粒却没有杂带呢？难道是污染了？  C7G1TCW[SF58G(2C}J`[8EV.png 第二个图 Lane1 15000marker；Lane2：从DH5α中提质粒Pet28a-701； Lane3 ：pet28a 空质粒；Lane4：从DH5α中提质粒Pet32a-701；Lane5：pet32a空质粒；Lane6:1Kb Ladder marker  UWXKV~715_{QEY(]MYZ(5FV.jpg 第三个图将pet28a-701和pet32a-701重组质粒转化至BL21后做的菌液PCR Lane1：2000marker；Lane2-5菌液PCR正确701bp（含有pet28a-701菌液中），Lane6：没加样；Lane：7-10 均为菌液PCR正确701bp（含有pet32a-701菌液中）  )2N@DJIE$S2X0O@N{9L@]0E.jpg |
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BL21（DE3）是蛋白表达型菌株，和DH5A不能比的，BL21（DE3）在用碱提法时我就常是两条带。楼主有三条带，最下面的是质粒双链断裂，线性化的质粒才和你的空载差不多，第二条是质粒单链断裂，第三条是环状质粒。你的博士朋友说的很对，它们都是一个质粒，被酶切以后，就线性化了，条带当然就一样了。楼主有PET28A,32A的空载的话，我们以后可以交换这些实验试剂呀 不过楼主的空载跑到了4500，换个marker 试试吧。 |
2楼2015-01-06 11:39:23
3楼2015-01-06 20:32:50
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你好 我想问一下 我的是pet21载体连接的目的片段 都用然后用的DH5a感受态细胞 然后提出来的质粒 然后用双酶切鉴定 后发现 两条带一条5000一条3000bp 但是我的目的条带应该是600 但是没有带 是不是不对呀 发自小木虫IOS客户端 |
4楼2016-01-04 16:12:49