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董董董小姐

铁虫 (初入文坛)

[交流] 求助！！！PCR灵敏性实验~！！

本人是做PCR的新手，现在正在做灵敏性实验，模板梯度稀释老是稀释不好，跑出的条带要么明暗度不好，要么高浓度没有条带低浓度铀条带。。。纠结的不行。。。特来请教各位虫友，有没有高手指点下，模板稀释过程中要注意一那些细节哇~！！！！！
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1楼 2015-01-04 11:06:00
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

红卫大兵

木虫 (正式写手)
★
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模板稀释你用母液稀释10背然后在用稀释10x的在稀释10x也就是说用1-10x-100x-1000x
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6楼2015-01-04 13:13:16
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linzshit

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回贴交流 2015-01-07 22:49:18
楼主的模板是什么啊，如果是质粒的话，你的梯度稀释时还可以看到一个比较好的亮度梯度的，如果是gDNA的话，很多时候是稀释度越高，PCR的效率越高，导致跑调带的时候也越亮，当然这个趋势不是无限制的，但在一定浓度内是这个样子。建议楼主如果只是验证PCR体系灵敏度，与模板类型无关的话，还是换成质粒，效果好点。不过我是不太明白，现在灵敏度还是跑胶后用软件ImageJ测光度吗，那个人为影响太大了，如果有荧光PCR的话就准确多了，当然这只是我想的啊，希望能够帮到你
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7楼2015-01-05 10:04:35
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普通回帖

syhorchid
★
董董董小姐(金币+1): 谢谢参与
2楼2015-01-04 11:07:48
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寻找cock
★
董董董小姐(金币+1): 谢谢参与
3楼2015-01-04 11:29:45
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time88
★
董董董小姐(金币+1): 谢谢参与
4楼2015-01-04 11:33:47
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hailinsu123
5楼2015-01-04 11:57:24
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puresnowlqin

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
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西门吹雪170: 2015-01-07 22:49:32
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回贴交流 2015-01-07 22:49:43
一类模板一个参考，不要质粒和基因组一个标准的稀释，还有质粒还有低拷贝和高拷贝呢都要在稀释的时候考虑进去。你可以把提取好的模板先跑个电泳，然后根据结果稀释。这样还可以验证模板提取的好不好。
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最喜欢的就是最好的。
8楼2015-01-05 15:34:00
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781055707

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回贴交流 2015-01-07 22:50:03
董董董小姐: 金币+5, 50ul原液是什么？？从哪来？？？ 2015-01-29 09:49:34
模板先取50ul在10+90DDH2O梯度稀释，一定要混匀，不要急，我一般做两条要稀释1个小时，一定要混匀，量要准，你要亲眼看着它打完最后的一滴。第一个模板就从你稀释时的50ul原液里取，别从1.5毫升EP管里取，不准。
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采菊东篱下，悠然见南山。
9楼2015-01-05 16:27:37
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781055707

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你可以做二组稀释，都跑电泳，没有的话你可以从二组里各挑好的和并成一组。
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采菊东篱下，悠然见南山。
10楼2015-01-05 17:00:46
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