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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 重叠PCR第一轮切割的200bp小片段总是有很多杂带且很暗，怎么办？
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odelay

铜虫 (小有名气)

[求助] 重叠PCR第一轮切割的200bp小片段总是有很多杂带且很暗，怎么办？ 已有1人参与

重叠PCR第一轮切割的200多bp小片段总是有很多杂带且很暗，怎么办？
第一轮PCR体系：dH2O      17.65μL
           5*Ps buffer     6μL
           dNTP          2.4μL
           DMSO         1.5μL
           Primxstar       0.15μL
           模板           1.5μL
           引物（P1、P2） 0.4μL
           或（P3、P4）
                                              ——30μL体系
PCR程序: 95︒C   05:00
           95︒C   01:00
           52︒C   01:00
           72︒C   1:40
           72︒C   10:00
           10︒C   结束
           30个循环

重叠PCR第一轮切割的200bp小片段总是有很多杂带且很暗，怎么办？
4 2014-12-02 19hr 07min.jpg
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1楼 2014-12-17 10:14:10
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odelay

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-12-17 16:25:53
降落PCR就是将前两个循环的退火温度设定比引物的Tm值高5℃，每两个循环降低2℃，降至Tm值低5℃，然后在采用此温度进行下面20-25个循环的PCR扩增...

听着很难啊，我摸索摸索，谢啦
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5楼2014-12-17 20:27:04
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
odelay: 金币+2 2014-12-17 15:21:53
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-17 19:51:20
非特异性扩增太多条带，切胶产物可能不是很纯，试着将退火温度提高几点试试，或者采用降落PCR，能够很好的减少非特异性扩增。
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rainwater
2楼2014-12-17 13:35:20
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odelay

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-12-17 13:35:20
非特异性扩增太多条带，切胶产物可能不是很纯，试着将退火温度提高几点试试，或者采用降落PCR，能够很好的减少非特异性扩增。

怎么个降落PCR法啊
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3楼2014-12-17 15:21:43
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-17 19:51:30
引用回帖:
3楼: Originally posted by odelay at 2014-12-17 15:21:43
怎么个降落PCR法啊...

降落PCR就是将前两个循环的退火温度设定比引物的Tm值高5℃，每两个循环降低2℃，降至Tm值低5℃，然后在采用此温度进行下面20-25个循环的PCR扩增
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rainwater
4楼2014-12-17 16:25:53
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