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lixiaoyi1981荣誉版主 (正式写手)
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5月份疑难问题汇总，请高手解答。
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第一次回答问题，呵呵
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问题10：NBT法测SOD酶活性 答：试试这个方法，我用此法做出来了的 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 小麦、玉米、水稻、棉花等新鲜叶片 2．主要仪器 （1）722型或其他型号的可见分光光度计 （2）万分之一分析天平 （3）高速冷冻离心机 （4）冰箱 （5）光照箱：4 500Lux （6）带盖瓷盘 1个/处理 （7）移液管架 （8）研钵 （9）离心管 5mL数个 （10）微烧杯 10～15mL 8个/处理 （11）移液管或加样器 0.5mL×4；1mL×2；2mL×2；5mL×1 （12）微量进样器 50μL×2；100μL×2 （13）烧杯 50mL×3；100mL×5；500mL×1；1 000mL×2 （14）量筒 50mL×1；100mL×2 （15）容量瓶 50mL×1；100mL×5；250mL×1；1 000mL×2 （16）细口瓶 125mL×5 3．试剂 （1）0.1 mol/L pH7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液 A液（0.1 mol/L Na2HPO4溶液）：准确称取Na2HPO4· 12H2O（MW=358.14）3.5814g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。 B液（0.1 mol/L NaH2PO4溶液）：准确称取NaH2PO4· 2H2O （MW=156.01）0.780g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入50mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。 取上述A液183mL与B液17mL充分混匀后即为0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液。4℃冰箱中保存备用。 （2）0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液 准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879g于100mL小烧杯中，用少量0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。4℃冰箱中保存可用1～2d。 （3）7.5 × 10－4 mol/L NBT溶液 准确称取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=817.7）0.1533g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。4℃冰箱中保存可用2～3d。 （4）含1.0μmol/L EDTA的2 × 10－5 mol/L核黄素溶液 A液：准确称取EDTA（MW=292）0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。 B液：准确称取核黄素（MW=376.36）0.0753g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。 C液：合并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此溶液为含0.1mmol/L EDTA的2mmol/L 核黄素溶液。4℃冰箱中保存可用8～10d。该溶液应避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，置于4℃冰箱中保存。 当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0μmol/L EDTA的2 × 10－5 mol/L 核黄素溶液。 （5）0.05 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液 取0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液50mL，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。 （6）石英砂。 四、操作方法和步骤 1．酶液的制备 按每克鲜叶加入3mL 0.05 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液，加入少量石英砂，于冰浴中的研钵内研磨成匀浆，定容到5mL刻度离心管中，于8 500 r/min（10 000g）冷冻离心30min，上清液即为SOD酶粗提液。 2．酶活力的测定 每个处理取8个洗净干燥好的微烧杯编号，按表1加入各试剂及酶液，反应系统总体积为3mL。其中4～8号杯中磷酸钠缓冲液量和酶液量可根据试验材料中酶液浓度及酶活力进行调整（如酶液浓度大、活性强时，酶用量适当减少）。 各试剂全部加入后，充分混匀，取1号微烧杯置于暗处，作为空白对照，比色时调零用。其余7个微烧杯均放在温度为25℃，光强为4 500Lux的光照箱内（安装有3根20W的日光灯管）照光15min，然后立即遮光终止反应。在560nm波长下以1号杯液调零，测定各杯液光密度并记录结果。以2、3号杯液光密度的平均值作为抑制NBT光还原率100％，根据其他各杯液的光密度分别计算出不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，作出二者相关曲线。找出50％抑制率的酶液量（μL）作为一个酶活力单位（U）。 表1 反应系统中各试剂及酶液的加入量（mL） 试 剂 试剂（5） 试剂（2） 试剂（3） 酶 液 试剂（4） 杯 号 1 0.9 1.5 0.3 0 0.3 2 0.9 1.5 0.3 0 0.3 3 0.9 1.5 0.3 0 0.3 4 0.85 1.5 0.3 0.05 0.3 5 0.80 1.5 0.3 0.10 0.3 6 0.75 1.5 0.3 0.15 0.3 7 0.70 1.5 0.3 0.20 0.3 8 0.65 1.5 0.3 0.25 0.3 五、结果计算 1．560nm波长下各杯液的光密度（表2） 表2 测定数据列表 杯 号 1 2 3 4 5 6 7 8 2、3号平均值 酶液量（mL）0 0 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 — 光密度 （OD560nm） 0 抑制率（％） — 100 100 100 以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线。找出50％抑制率的酶液量（μL）作为一个酶活力单位（U）。 2．SOD酶活力按下式计算 A＝（ V × 1000 × 60）/（B × W × T） 式中各因子代表内容如下： A：为酶活力（酶活力单位：U/g（FW）·h）； V：为酶提取液总体积（mL）； B：为一个酶活力单位的酶液量（μL）； W：为样品鲜重（g）； T：为反应时间（min）； 1 000：为1mL = 1 000μL； 60：为1h = 60min。 3．抑制率按下式计算 抑制率=（ （D1—D2）/ D1）×100％ 式中各因子代表内容如下： D1：为2、3号杯液的光密度平均值； D2：为加入不同酶液量的各杯液的光密度值。 注：有时因测定样品的数量多，每个样品均按此法测定酶活力工作量将会很大，也可每个样品只测定1个或2个酶液用量的光密度值，按下式计算酶活力。 A＝（ (D1－D2) × V × 1000 × 60）/（D1 × B × W × T × 50％） 式中各因子代表如下： D1：为2、3号杯液的光密度平均值； D2：为测定样品酶液的光密度； 50％：为抑制率50％； 其它各因子代表的内容与上述SOD酶活力计算公式的各因子代表的内容相同。 六、注意事项 1．富含酚类物质的植物（如茶叶）在匀浆时产生大量的多酚类物质，会引起酶蛋白不可逆沉淀，使酶失去活性，因此在提取此类植物SOD酶时，必须添加多酚类物质的吸附剂，将多酚类物质除去，避免酶蛋白变性失活，一般在提取液中加1～4％的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。 2．测定时的温度和光化反应时间必须严格控制一致。为保证各微烧杯所受光强一致，所有微烧杯应排列在与日光灯管平行的直线上。   |
13楼2008-07-11 22:20:50
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lixiaoyi1981(金币+10,VIP+0):好详细，第一个“搬城门木头”的人，重奖。谢谢
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顶一下斑斑": 问题 16: 关于PAGE的3个问题 用水、盐、和醇分别提取的植物种子的蛋白 1、有听说溴酚兰点在电极缓冲液中的吗？我一直点在样品里，现在有点在电极缓冲液中的，对其原理和操作，很不明白 答:有这种情况,溴芬兰无论在点样空,还是在buffer 都是一样的原理,都是起到知识的作用, 通常大家都喜欢和样品混合一起点到样孔,但是有些人考虑到 page的胶孔透光性很强,很难点样,何容易串样,所以在整个buffer中加入溴芬兰,这样的效果是的点样井清晰可见. 而且对电泳没有任何影响. 2、胶跑的过程中不直，是怎么回事？ 两个问题: 1 胶的pH和电泳buffer的pH 2, 电泳过程产生大量热, 胶表面受热不均匀. 3、跑完洗脱后，发现刚开始进入分离胶的地方，谱带呈栅栏状，再往下就没事了，是怎么回事？ 答:没有明白: 既然跑完,那就是溴芬兰到胶底部,你怎么就能看到物质刚到分离胶的位置, 如果你能看到物质的位置,我们就不需要染色了. 图谱栅栏状,最大可能就是TBE有问题,离子强度有问题,或者使用不纯的水. 什么叫下面没事了,不知所云. |
2楼2008-05-20 08:57:48
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3楼2008-05-20 09:03:53
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