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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » DGGE切胶回收后测序，结果全是双峰？！
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shully

新虫 (小有名气)

[求助] DGGE切胶回收后测序，结果全是双峰？！ 已有3人参与

送出去测序，73个样品，只有4个是已通，其余的全是双峰。请问这是怎么回事呢？
切胶后回收的PCR程序没有用之前的那个，是一个简单得多的，是因为这个原因吗？
还是我切胶的技术太差，全割成几个条带一块儿的了？
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1楼 2014-11-14 14:31:08
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shully

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by myrazhang at 2014-11-17 17:04:28
看你的样品是不是微生物量很丰富，如果微生物量较大，相似微生物群落较多的话，可能是你的DGGE并没彻底分开不同菌株，所以建议优化变性剂的梯度~或者切胶回收的DNA样品，再用相同带GC夹子的引物PCR，扩增产物再做DG ...

我有这样做过，用第一次DGGE梯度，将切割回收的样品用带GC夹子引物PCR后再次用相同梯度浓度DGGE，但结果的条带都不在原来的位置了，而且都有很多条
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5楼2014-11-20 10:14:50
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微基生物

捐助贵宾 (小有名气)

技术专员
感谢参与，应助指数 +1
youlinglyw: 应助指数-1, 非应助 2014-11-22 12:13:54
你是TA克隆后做的测序吗？
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专注微生物多样性分析QQ2758452825
2楼2014-11-14 15:03:19
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shully

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 微基生物 at 2014-11-14 15:03:19
你是TA克隆后做的测序吗？

不是，我们这边没条件，是PCR后送到外边去测序，好像说如果结果不好再TA克隆吧
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3楼2014-11-14 16:10:41
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myrazhang

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

看你的样品是不是微生物量很丰富，如果微生物量较大，相似微生物群落较多的话，可能是你的DGGE并没彻底分开不同菌株，所以建议优化变性剂的梯度~或者切胶回收的DNA样品，再用相同带GC夹子的引物PCR，扩增产物再做DGGE，这样既能检测是否单条带，又能再次分离杂条带。
但是，据 Yang 和 Crowley （ 2004 ）的研究发现有时同一 DGGE 条带可能含有两种或两种以上的微生物。所以~DGGE能反映多样性和丰富度，但是作为菌群检测，还是应该选择更先进的方法了哈~
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4楼2014-11-17 17:04:28
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