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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

[求助] 目的片段连上了pEASY-Blunt simple,不知道怎么进行酶切鉴定,求助! 已有3人参与

我的目的片段没有设计酶切位点,完全是平末端连上的。载体是pEASY-blunt simple,消除了一些多克隆位点。
  倒是可以提质粒再做,不过我舍友也有没设计酶切位点的,用的是T载体,然后可以设计酶切位点。
  我理解的是,如果在我的目的片段两端有酶切位点,那我就可以用这两个点切。
  但是pEASY-blunt simple里目的片段是插入LacZ里的,我也找不到这个载体的图谱,不知道有没有做过这个的同学?能不能指教一二。
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hmily890404

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我一直都在用这个载体,一直都是用的M13鉴定的。拉出来的载体片段跟你的片段应该不是特别影响,载体片段比较大,4KB左右。用你自己基因里面的酶切位点鉴定也可以。不过我最近连接这个载体出了点问题,之前一连就连上了,最近两次怎么连都连不上,还要请教是个什么情况。。。
5楼2015-03-25 14:52:27
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查看全部 6 个回答

super_mm

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 鼓励交流 2014-10-13 15:55:43
pEASY Blunt simple主要是用PCR鉴定的,好像连接区没有什么合适的酶切位点,如果你的PCR引物上没加酶切位点,就找不到合适的酶切位点验证了,你用的是全式金的吗?图谱有啊,这里http://www.transgen.com.cn/products/63.html
2楼2014-10-13 11:09:18
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圆yy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 鼓励交流 2014-10-13 15:55:46
这个载体的mcs被切除啦,你可以用vector看看目的片段插入这个载体附近的酶切位点有哪些再切吧。要不然换个载体,有多克隆位点的。
3楼2014-10-13 11:21:12
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by super_mm at 2014-10-13 11:09:18
pEASY Blunt simple主要是用PCR鉴定的,好像连接区没有什么合适的酶切位点,如果你的PCR引物上没加酶切位点,就找不到合适的酶切位点验证了,你用的是全式金的吗?图谱有啊,这里http://www.transgen.com.cn/produc ...

说明书上的图谱不全呀,说明书上不是还让自己登陆网站查阅酶切位点分析吗?难道是看那个全序列……
  我按说明书用的M13上下游引物,不知道这样鉴定重组子出来的片段是什么样的?因为它不是特异性的P出目的片段,还带有一些载体的序列。
4楼2014-10-13 15:41:41
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