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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 目的片段连上了pEASY-Blunt simple，不知道怎么进行酶切鉴定，求助！
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

[求助] 目的片段连上了pEASY-Blunt simple，不知道怎么进行酶切鉴定，求助！ 已有3人参与

我的目的片段没有设计酶切位点，完全是平末端连上的。载体是pEASY-blunt simple，消除了一些多克隆位点。
  倒是可以提质粒再做，不过我舍友也有没设计酶切位点的，用的是T载体，然后可以设计酶切位点。
  我理解的是，如果在我的目的片段两端有酶切位点，那我就可以用这两个点切。
  但是pEASY-blunt simple里目的片段是插入LacZ里的，我也找不到这个载体的图谱，不知道有没有做过这个的同学？能不能指教一二。
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1楼 2014-10-12 15:43:03
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圆yy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 鼓励交流 2014-10-13 15:55:46
这个载体的mcs被切除啦，你可以用vector看看目的片段插入这个载体附近的酶切位点有哪些再切吧。要不然换个载体，有多克隆位点的。
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3楼2014-10-13 11:21:12
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super_mm

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 鼓励交流 2014-10-13 15:55:43
pEASY Blunt simple主要是用PCR鉴定的，好像连接区没有什么合适的酶切位点，如果你的PCR引物上没加酶切位点，就找不到合适的酶切位点验证了，你用的是全式金的吗？图谱有啊，这里http://www.transgen.com.cn/products/63.html
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2楼2014-10-13 11:09:18
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by super_mm at 2014-10-13 11:09:18
pEASY Blunt simple主要是用PCR鉴定的，好像连接区没有什么合适的酶切位点，如果你的PCR引物上没加酶切位点，就找不到合适的酶切位点验证了，你用的是全式金的吗？图谱有啊，这里http://www.transgen.com.cn/produc ...

说明书上的图谱不全呀，说明书上不是还让自己登陆网站查阅酶切位点分析吗？难道是看那个全序列……
  我按说明书用的M13上下游引物，不知道这样鉴定重组子出来的片段是什么样的？因为它不是特异性的P出目的片段，还带有一些载体的序列。
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4楼2014-10-13 15:41:41
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hmily890404

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我一直都在用这个载体，一直都是用的M13鉴定的。拉出来的载体片段跟你的片段应该不是特别影响，载体片段比较大，4KB左右。用你自己基因里面的酶切位点鉴定也可以。不过我最近连接这个载体出了点问题，之前一连就连上了，最近两次怎么连都连不上，还要请教是个什么情况。。。
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5楼2015-03-25 14:52:27
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