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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请教pPIC9载体上xhoI位点明明说是特异性的，为什么分析切得到了二个位置有。。
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Dearstar

新虫 (小有名气)

[交流] 请教pPIC9载体上xhoI位点明明说是特异性的，为什么分析切得到了二个位置有。。 已有1人参与

pPIC9载体说明上说，载体构建过程中，可供使用的单一限制性内切酶位点为Xho I, SnaB I, EcoR I, Avr II, Not I.

为什么分析了pPIC9的序列却发现二个位置有xho I这个酶切位点， 一个是1192.一个是5709。真心不知道如果以后用xhoI 酶切的时候会怎么样。有没有做过的指导一下。

另外如果我要是选择将我的目的片断插入到pPIC9K中，选择用Ecor I 和 Not I 的话，信号肽酶切位点之后， 到Ecor I的几个氨基酸是怎么去掉的。
小妹初入酵母，还不是特别明白，跪求高手指教啊
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1楼 2014-08-29 09:34:01
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)
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Dearstar(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-29 20:50:08
那就是多了几个氨基酸，避免不了的，有可能有多余的抗原性

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2楼2014-08-29 09:38:48
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happydove

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Dearstar(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-29 20:50:18
如果选用Ecor I 和 Not I 的话，就会切掉Avr II酶切位点，其他没什么。
载体介绍说是单一酶切位点，如果你构建酵母表达质粒，选用双酶切位点，避开这个酶切位点就可以啦。
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3楼2014-08-29 11:27:41
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caihang

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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-08-29 23:51:12
xhoI和sacI酶切位点非常像，不建议用xhoI，因为它是平滑末端，连接效率比粘性末端低很多。
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4楼2014-08-29 22:11:09
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kehan777

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Dearstar(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:22:22
1，信号肽酶切位点之后， 到EcoRI的几个氨基酸是怎么去掉的？
看序列，α-Factor secretion signal(s)（949-1218），EcoRI之前，只后只多出了GTA,这三个碱基，也就是1个AA，应该没什么影响。
2，EcoRI,NotI 双酶切载体，如果XhoI有两个酶切位点（分析确实有），则出现三个条带，一个是很小的条带（舍弃），另外两个是比较大的（两EcoRI之间的，NotI 和EcoRI‘之间），回收两个大条带，然后和你的目的片段（EcoRI,NotI ）连接：
如果是三片段同时连接，连接后可能出现“两EcoRI之间的”正向插入，反向插入，没有插入三种情况，可以挑多一两个克隆，先提质粒看条带大小，然后选择符合大小的样品，加设计一条引物测序验证。
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5楼2014-08-31 22:02:37
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Dearstar

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5楼: Originally posted by kehan777 at 2014-08-31 22:02:37
1，信号肽酶切位点之后， 到EcoRI的几个氨基酸是怎么去掉的？
看序列，α-Factor secretion signal(s)（949-1218），EcoRI之前，只后只多出了GTA,这三个碱基，也就是1个AA，应该没什么影响。
2，EcoRI,NotI 双酶切 ...

你好，非常感谢你的回复。
前面是不是多了二三个AA呢，我看好像不止一个呢，还有后面，到TAA还有几个氨基酸，这是怎么去掉的呢，你提醒了我后面也有啊。我是不是应该在我的序列后面加一个终止子呢，因为我的序列是全合成的，直接合成进质粒。为什么说多一二个没有什么关系呢，我的全长也就是一个小肽呢，才四五十个AA。
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6楼2014-09-01 09:04:57
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Dearstar

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4楼: Originally posted by caihang at 2014-08-29 22:11:09
xhoI和sacI酶切位点非常像，不建议用xhoI，因为它是平滑末端，连接效率比粘性末端低很多。

恩，好的，谢谢你的提醒。
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7楼2014-09-01 09:35:21
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Dearstar

新虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by happydove at 2014-08-29 11:27:41
如果选用Ecor I 和 Not I 的话，就会切掉Avr II酶切位点，其他没什么。
载体介绍说是单一酶切位点，如果你构建酵母表达质粒，选用双酶切位点，避开这个酶切位点就可以啦。

恩，好的，那你知道怎么样才能形成天然的N端吗
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8楼2014-09-01 09:36:04
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Dearstar

新虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by bio_sci at 2014-08-29 09:38:48
那就是多了几个氨基酸，避免不了的，有可能有多余的抗原性

恩，好的，谢谢，那怎么办呢，我的是短肽，一共只有四五十个啊，前面多一个都不行啊。。
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9楼2014-09-01 09:36:57
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kehan777

木虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:22:31
引用回帖:
6楼: Originally posted by Dearstar at 2014-09-01 09:04:57
你好，非常感谢你的回复。
前面是不是多了二三个AA呢，我看好像不止一个呢，还有后面，到TAA还有几个氨基酸，这是怎么去掉的呢，你提醒了我后面也有啊。我是不是应该在我的序列后面加一个终止子呢，因为我的序列是 ...

可以的话，把你的序列复制到这上面来，基因序列和载体的用大小写区分开，或者你自己再画一画图谱再确认一下。
你的框架应该是：信号肽（已含ATG)+个别氨基酸+EcoRI+目的基因+终止密码子+NotI
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10楼2014-09-01 18:42:11
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