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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请教pPIC9载体上xhoI位点明明说是特异性的，为什么分析切得到了二个位置有。。
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Dearstar

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by kehan777 at 2014-09-01 18:42:11
可以的话，把你的序列复制到这上面来，基因序列和载体的用大小写区分开，或者你自己再画一画图谱再确认一下。
你的框架应该是：信号肽（已含ATG)+个别氨基酸+EcoRI+目的基因+终止密码子+NotI...

恩，你说的完全正确，框架就是这个样子的，其实我想了想前面的AA如果不影响分泌的话，反正最终我还要用酶把目标序列前面几个AA剪切掉的，所以想来想去，决定两个一起做，一边是就这么表达，另外一边是基因敲除掉这些个多余的DNA，你觉得呢？但是这么9.5kb长的DNA，还不知道PCR用什么条件才好啊！
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11楼2014-09-02 08:41:36
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kehan777

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
11楼: Originally posted by Dearstar at 2014-09-02 08:41:36
恩，你说的完全正确，框架就是这个样子的，其实我想了想前面的AA如果不影响分泌的话，反正最终我还要用酶把目标序列前面几个AA剪切掉的，所以想来想去，决定两个一起做，一边是就这么表达，另外一边是基因敲除掉这 ...

1. 先确认真的是有几个AA，我的只多1个AA，你可以把你序列上的“肽信号肽+个别氨基酸+EcoRI”这一段复制上来核对一下。如果只有1个AA，即三个碱基的话，可以考虑设计引物去除
2. 请问你用什么酶切掉AA？还是说你的目的基因上已加入了蛋白酶切位点？
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12楼2014-09-02 10:36:38
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Dearstar

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by kehan777 at 2014-09-02 10:36:38
1. 先确认真的是有几个AA，我的只多1个AA，你可以把你序列上的“肽信号肽+个别氨基酸+EcoRI”这一段复制上来核对一下。如果只有1个AA，即三个碱基的话，可以考虑设计引物去除
2. 请问你用什么酶切掉AA？还是说你的 ...

加上Ecor I 酶切位点表达的2个，一共是四个，我正是打算设计一个长引物将其做缺失突变。没有加蛋白酶切位点。
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13楼2014-09-02 13:56:02
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