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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请教pPIC9载体上xhoI位点明明说是特异性的，为什么分析切得到了二个位置有。。
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Dearstar

新虫 (小有名气)

[交流] 请教pPIC9载体上xhoI位点明明说是特异性的，为什么分析切得到了二个位置有。。 已有1人参与

pPIC9载体说明上说，载体构建过程中，可供使用的单一限制性内切酶位点为Xho I, SnaB I, EcoR I, Avr II, Not I.

为什么分析了pPIC9的序列却发现二个位置有xho I这个酶切位点， 一个是1192.一个是5709。真心不知道如果以后用xhoI 酶切的时候会怎么样。有没有做过的指导一下。

另外如果我要是选择将我的目的片断插入到pPIC9K中，选择用Ecor I 和 Not I 的话，信号肽酶切位点之后， 到Ecor I的几个氨基酸是怎么去掉的。
小妹初入酵母，还不是特别明白，跪求高手指教啊
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1楼 2014-08-29 09:34:01
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Dearstar

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by kehan777 at 2014-09-01 18:42:11
可以的话，把你的序列复制到这上面来，基因序列和载体的用大小写区分开，或者你自己再画一画图谱再确认一下。
你的框架应该是：信号肽（已含ATG)+个别氨基酸+EcoRI+目的基因+终止密码子+NotI...

恩，你说的完全正确，框架就是这个样子的，其实我想了想前面的AA如果不影响分泌的话，反正最终我还要用酶把目标序列前面几个AA剪切掉的，所以想来想去，决定两个一起做，一边是就这么表达，另外一边是基因敲除掉这些个多余的DNA，你觉得呢？但是这么9.5kb长的DNA，还不知道PCR用什么条件才好啊！
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11楼2014-09-02 08:41:36
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bio_sci

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Dearstar(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-29 20:50:08
那就是多了几个氨基酸，避免不了的，有可能有多余的抗原性

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2楼2014-08-29 09:38:48
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happydove

新虫 (小有名气)
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Dearstar(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-29 20:50:18
如果选用Ecor I 和 Not I 的话，就会切掉Avr II酶切位点，其他没什么。
载体介绍说是单一酶切位点，如果你构建酵母表达质粒，选用双酶切位点，避开这个酶切位点就可以啦。
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3楼2014-08-29 11:27:41
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caihang

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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-08-29 23:51:12
xhoI和sacI酶切位点非常像，不建议用xhoI，因为它是平滑末端，连接效率比粘性末端低很多。
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4楼2014-08-29 22:11:09
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