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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请教pPIC9载体上xhoI位点明明说是特异性的，为什么分析切得到了二个位置有。。
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Dearstar

新虫 (小有名气)

[交流] 请教pPIC9载体上xhoI位点明明说是特异性的，为什么分析切得到了二个位置有。。 已有1人参与

pPIC9载体说明上说，载体构建过程中，可供使用的单一限制性内切酶位点为Xho I, SnaB I, EcoR I, Avr II, Not I.

为什么分析了pPIC9的序列却发现二个位置有xho I这个酶切位点， 一个是1192.一个是5709。真心不知道如果以后用xhoI 酶切的时候会怎么样。有没有做过的指导一下。

另外如果我要是选择将我的目的片断插入到pPIC9K中，选择用Ecor I 和 Not I 的话，信号肽酶切位点之后， 到Ecor I的几个氨基酸是怎么去掉的。
小妹初入酵母，还不是特别明白，跪求高手指教啊
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1楼 2014-08-29 09:34:01
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kehan777

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Dearstar(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:22:22
1，信号肽酶切位点之后， 到EcoRI的几个氨基酸是怎么去掉的？
看序列，α-Factor secretion signal(s)（949-1218），EcoRI之前，只后只多出了GTA,这三个碱基，也就是1个AA，应该没什么影响。
2，EcoRI,NotI 双酶切载体，如果XhoI有两个酶切位点（分析确实有），则出现三个条带，一个是很小的条带（舍弃），另外两个是比较大的（两EcoRI之间的，NotI 和EcoRI‘之间），回收两个大条带，然后和你的目的片段（EcoRI,NotI ）连接：
如果是三片段同时连接，连接后可能出现“两EcoRI之间的”正向插入，反向插入，没有插入三种情况，可以挑多一两个克隆，先提质粒看条带大小，然后选择符合大小的样品，加设计一条引物测序验证。
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5楼2014-08-31 22:02:37
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bio_sci

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Dearstar(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-29 20:50:08
那就是多了几个氨基酸，避免不了的，有可能有多余的抗原性

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2楼2014-08-29 09:38:48
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happydove

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Dearstar(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-29 20:50:18
如果选用Ecor I 和 Not I 的话，就会切掉Avr II酶切位点，其他没什么。
载体介绍说是单一酶切位点，如果你构建酵母表达质粒，选用双酶切位点，避开这个酶切位点就可以啦。
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3楼2014-08-29 11:27:41
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caihang

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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-08-29 23:51:12
xhoI和sacI酶切位点非常像，不建议用xhoI，因为它是平滑末端，连接效率比粘性末端低很多。
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4楼2014-08-29 22:11:09
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