蛋白质相互作用研究蛋白A能pull-down蛋白B 反之检测不出 - 分子生物 - 生物化学

心怀希望，放飞梦想！

11楼2014-08-19 10:24:49

sakura01_22

木虫 (小有名气)

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10楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-08-19 02:01:11
任何一种实验技术都有系统误差和局限性，很多时候，我们无法去具体解决为什么会如此，但是如果有条件能够深入一些讨论，还是会有不一样的收获。楼主的问题挺有价值！值得讨论！

特别感激亲的回复，我在考虑蛋白相互作用时，一直在考虑间接相互作用，却忽略了蛋白相互作用的基本原理，失误，失误。听亲的一番讲解，才恍然大悟，我再深入去了解一下，再次谢谢亲的解释，希望能多交流！

心怀希望，放飞梦想！

12楼2014-08-19 10:34:12

凌波丽

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楼主提的问题很不错！

本帖也收入了我即将在本月底发布在小木虫的“小木虫生物综合版与分子生物版冷点问题讨论——凌波丽个人总结第六季”（目前是112页，5号字，76000+字）。

13楼2014-08-19 11:59:07

凌波丽

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12楼: Originally posted by sakura01_22 at 2014-08-19 10:34:12
特别感激亲的回复，我在考虑蛋白相互作用时，一直在考虑间接相互作用，却忽略了蛋白相互作用的基本原理，失误，失误。听亲的一番讲解，才恍然大悟，我再深入去了解一下，再次谢谢亲的解释，希望能多交流！...

以后可以多多交流！互通有无。

14楼2014-08-19 11:59:36

siriusxuan

木虫 (正式写手)

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8楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-08-19 01:30:50
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation） ...

蛋白结合以后可能会遮挡抗原决定簇的观点很有启发性，但跑胶时加上样缓冲液又煮沸的过程，大部分蛋白质X和蛋白质Y的相互作用都会分开的吧，因此即使两种蛋白结合过程中遮盖了抗原决定簇，也不会影响到抗体检测蛋白质吧。

此座可言轻社稷，江山万里起风尘。

15楼2014-08-20 10:16:15

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15楼: Originally posted by siriusxuan at 2014-08-20 10:16:15
蛋白结合以后可能会遮挡抗原决定簇的观点很有启发性，但跑胶时加上样缓冲液又煮沸的过程，大部分蛋白质X和蛋白质Y的相互作用都会分开的吧，因此即使两种蛋白结合过程中遮盖了抗原决定簇，也不会影响到抗体检测蛋白 ...

你说的是WB吧！？免疫共沉淀的最后一步才是WB。

16楼2014-08-20 12:28:52

凌波丽

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免疫识别那一步有变性吗！？

17楼2014-08-20 12:31:08

凌波丽

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有人还是先去看看免疫共沉淀的实验的原理吧！免疫识别发生在细胞尚未裂解时！！！而后是抗其中一个蛋白质的单抗与其中一个蛋白质发生免疫识别！这步能够使蛋白质变性吗！！？？变性了还免疫识别个鬼呀！除非免疫簇就是序列免疫簇。
”The procedure for immunoprecipitation is outlined in Fig. 1. In the first step, cells are transfected with plasmids coding for a bait protein and its potential ligand, the target protein. These cells are lysed with a gentle detergenttreatment, creating a lysate containing bait–target complexes along with many irrelevant proteins. A capture antibody that specifically recognizes the bait protein is added to the lysates, forming a new antibody–bait–target complex. The antibody is then used as a handle to immobilize the proteins on inert Sepharose beads that are covalently coupled to Protein A, which stably binds the constant regions of many types of antibodies. At this point, those proteins not immobilized on beads are removed by a series of washes. Finally, the bait-protein complexes are eluted from the beads and dissociated by boiling in SDS. The presence or absence of the target protein, which is the endpoint of the assay, is evaluated by Western blot.“——————Haian Fu edits ,Protein-Protein Interactions:Methods and Applications,Humana Press,2004，338.

18楼2014-08-20 12:39:57

凌波丽

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有人还是先去看看免疫共沉淀的实验的原理吧！免疫识别发生在细胞尚未裂解时！！！而后裂解细胞，然后是抗其中一个蛋白质的单抗与其中一个蛋白质发生免疫识别！这步能够使蛋白质变性吗！！？？变性了还免疫识别个鬼呀！除非免疫簇就是序列免疫簇。

煮沸洗脱和WB与这些步骤重叠吗？！还是煮沸洗脱和WB在蛋白质-蛋白质相互作用和免疫识别之前！！？？
图1摘自：Haian Fu edits ,Protein-Protein Interactions:Methods and Applications,Humana Press,2004，339.

图1.JPG

19楼2014-08-20 12:46:27

凌波丽

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更正：有人还是先去看看免疫共沉淀的实验的原理吧！蛋白质-蛋白质相互作用（不是免疫识别，上面写错了）发生在细胞尚未裂解时！！！而后裂解细胞，然后是抗其中一个蛋白质的单抗与其中一个蛋白质发生免疫识别！这步能够使蛋白质变性吗！！？？变性了还免疫识别个鬼呀！除非免疫簇就是序列免疫簇。
“Finally, the bait-protein complexes are eluted from the beads and dissociated by boiling in SDS. The presence or absence of the target protein, which is the endpoint of the assay, is evaluated by Western blot.“——————Haian Fu edits ,Protein-Protein Interactions:Methods and Applications,Humana Press,2004，338.”是在上图的最后一步;"The beads are then washed free of irrelevant proteins, and the antibody, bait, and target are eluted by boiling."蛋白质-蛋白质相互作用还是免疫识别，如果能够实现，都在煮沸洗脱和WB之前就完成了，如果蛋白质-蛋白质相互作用还是免疫识别，如果不能够实现，煮沸洗脱和WB就更加不会使得"蛋白质-蛋白质相互作用还是免疫识别实现。请搞清楚实验流程的顺序！

20楼2014-08-20 12:52:08