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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 蛋白质相互作用研究 蛋白A能pull-down蛋白B 反之检测不出
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
抗体也可以用多克隆抗体，不过这样试验的假阳性会增加。
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21楼2014-08-20 12:53:52
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+5, 鼓励回帖交流 2014-08-20 16:49:11
有人还是先去看看免疫共沉淀的实验的原理吧！所要研究的可能存在相互作用的两种蛋白质——蛋白质X和蛋白质Y的彼此如果发生了相互作用是发生在细胞尚未裂解时！！！而后是抗其中一个蛋白质的单抗与其中一个蛋白质发生免疫识别！这步能够使蛋白质变性吗！！？？变性了还免疫识别个鬼呀！除非免疫簇就是序列免疫簇。序列免疫簇也是WB的实验基础原理之一，但是也是WB的局限性，WB不能检测出空间抗原免疫簇因为热煮沸和SDS变性而被破坏了的蛋白质！

免疫共沉淀的实验流程和简图如下：
“The procedure for immunoprecipitation is outlined in Fig. 1. In the first step, cells are transfected with plasmids coding for a bait protein and its potential ligand, the target protein. These cells are lysed with a gentle detergenttreatment, creating a lysate containing bait–target complexes along with many irrelevant proteins. A capture antibody that specifically recognizes the bait protein is added to the lysates, forming a new antibody–bait–target complex. The antibody is then used as a handle to immobilize the proteins on inert Sepharose beads that are covalently coupled to Protein A, which stably binds the constant regions of many types of antibodies. At this point, those proteins not immobilized on beads are removed by a series of washes. Finally, the bait-protein complexes are eluted from the beads and dissociated by boiling in SDS. The presence or absence of the target protein, which is the endpoint of the assay, is evaluated by Western blot.”
——————From : Haian Fu edits ,Protein-Protein Interactions:Methods and Applications,Humana Press,2004，338.

Haian Fu edits ,Protein-Protein Interactions:Methods and Applications,Humana Press,2004，
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7764403
蛋白质相互作用研究 蛋白A能pull-down蛋白B 反之检测不出
图1.JPG
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22楼2014-08-20 13:14:17
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
我再明确地说一下。最后的WB的检测对象是由前面的免疫共沉淀形成的antibody–bait–target complex-protein A-beads在沸水和SDS处理下形成的需要检测在细胞内能够相互作用的蛋白质X和蛋白质Y，如果蛋白质X和蛋白质Y在细胞中的确能够发生非共价的相互作用的话，而且识别蛋白质X和蛋白质Y两者之一的抗体能够在非变性条件下识别其抗原的话，也就是“A capture antibody that specifically recognizes the bait protein is added to the lysates, forming a new antibody–bait–target complex”，这样antibody–bait–target complex中的抗体连接有bead的蛋白质A识别并且非共价连接，这样antibody–bait–target complex-protein A-beads这个巨型分子复合体才形成了，但是到目前为止，antibody–bait–target complex-protein A-beads这个巨型分子复合体和其他无关的蛋白质都还是混合在细胞裂解液里。
直到这一步不可能使用剧烈的变性剂，虽然"these cells are lysed with a gentle detergent treatment, creating a lysate containing bait–target complexes along with many irrelevant proteins",但是细胞裂解不是一定要用gentle detergent treatment，用研磨、超声波等也可以，不要太剧烈，也可以几种细胞破碎方法并行。
既然antibody–bait–target complex-protein A-beads这个巨型分子复合体和其他无关的蛋白质都还是混合在细胞裂解液里，怎么把他们提取出来？就用低温离心即可，antibody–bait–target complex-protein A-beads这个巨型分子复合体比细胞裂解液中的其他蛋白质和任何生物大分子及其复合体都要沉得多，所以一旦高速离心，首先会沉底。然后把沉底物上的上清液倒掉，获得沉淀物。这样免疫共沉淀这步才算是完成了，之前的基因构建和表达（可能是异位表达）、细胞培养和收集细胞等当然也要做，而且都在细胞裂解之前。
但是直到此时我们仍然不知道低温离心获得的沉淀物究竟是antibody–bait–target complex-protein A-beads，还是仅仅是antibody-protein A-beads或者是antibody–bait-protein A-beads（就是说bait与target根本没有发生相互作用），我们无从知晓，那怎么办，这要用WB去检测沉淀物被煮沸和SDS化中的蛋白质成员中有没有target，甚至好要检测bait。
在楼主的试验中，如果被检测可能发生相互作用的两种蛋白质——蛋白质X和蛋白质Y在细胞中的确发生了相互作用，而蛋白质X的分子表面的抗原免疫簇，既没有受到空间位阻的遮挡，也没有因为X可能发生了部分重折叠而改变了抗原免疫簇，那么用抗X蛋白质的抗体当然可以用免疫共沉淀检测出X-Y发生了相互作用，因为抗蛋白质X的抗体与蛋白质X顺利的发生了免疫识别，而后抗蛋白质X的抗体又被beads—Protein A上的识别抗体的Protein A给粘上。
但是如果蛋白质X和蛋白质Y发生了相互作用，而蛋白质Y的分子表面的抗原免疫簇，受到空间位阻的遮挡，或者蛋白质Y的分子表面的抗原免疫簇干脆就在X与Y两者的接触面里，这时后加入细胞裂解液里的抗Y蛋白质的抗体上哪里去和蛋白质Y发生免疫识别（没有抗原免疫簇或者难以接近抗原免疫簇），尤其是抗Y蛋白质的抗体是单克隆抗体时，其识别的抗原免疫簇是唯一的。做个不太恰当的比喻：小三虽然有魅力，但是原配夫人在场时一般还是没有可能上位的。又或者Y在X相互作用过程中，Y可能发生了部分重折叠而改变了Y分子表面的抗原免疫簇，那么在第二种情况下，用抗Y蛋白质的抗体肯定无法免疫共沉淀检测出X-Y发生了相互作用，洗出来就是：抗Y蛋白质的抗体—Protein A—beads，没有蛋白质X和蛋白质Y两位主角的事情了，那实验当然失败了。那么也就是说：antibody–bait–target complex-protein A-beads这个巨型分子复合体根本不会形成！低温离心获得的沉淀物只是antibody-protein A-beads，后者被煮沸和SDS化出来只有antibody和protein A-beads，而WB的抗体时抗target（蛋白质X或者蛋白质Y）的序列抗原免疫簇的，因为是事先制备好的，所以有target（蛋白质X或者蛋白质Y）存在就能够用WB检测出来。但是WB检测的对象的免疫共沉淀物的成分（不然去检测低温离心沉淀时的上清液吗？！）——不然实验还有意义吗！？在上面我说的情况中，就没有antibody–bait–target complex-protein A-beads这个巨型分子复合体根本不会形成！难道弃去上清液收沉淀后，再用煮沸和SDS化居然能够从antibody-protein A-beads沉淀物中变出target（蛋白质X或者蛋白质Y）！？既然变不出来，WB检测谁呀？难道去检测空气吗？
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23楼2014-08-21 11:26:32
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