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sakura01_22木虫 (小有名气)
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[求助]
蛋白质相互作用研究 蛋白A能pull-down蛋白B 反之检测不出
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| 如题，在蛋白质相互作用研究中，IP检测，蛋白A能拉下蛋白B，但是蛋白B IP蛋白A时，检测不出。重复3遍左右，依然检测不出，希望哪位虫友能帮忙解答一下。是否存在相互作用只能单方面pull-down的情况，这种情况如何解释？ |
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西门吹雪170: 金币+5, 鼓励回帖交流 2014-08-20 16:49:11
西门吹雪170: 金币+5, 鼓励回帖交流 2014-08-20 16:49:11
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有人还是先去看看免疫共沉淀的实验的原理吧！所要研究的可能存在相互作用的两种蛋白质——蛋白质X和蛋白质Y的彼此如果发生了相互作用是发生在细胞尚未裂解时！！！而后是抗其中一个蛋白质的单抗与其中一个蛋白质发生免疫识别！这步能够使蛋白质变性吗！！？？变性了还免疫识别个鬼呀！除非免疫簇就是序列免疫簇。序列免疫簇也是WB的实验基础原理之一，但是也是WB的局限性，WB不能检测出空间抗原免疫簇因为热煮沸和SDS变性而被破坏了的蛋白质！ 免疫共沉淀的实验流程和简图如下： “The procedure for immunoprecipitation is outlined in Fig. 1. In the first step, cells are transfected with plasmids coding for a bait protein and its potential ligand, the target protein. These cells are lysed with a gentle detergenttreatment, creating a lysate containing bait–target complexes along with many irrelevant proteins. A capture antibody that specifically recognizes the bait protein is added to the lysates, forming a new antibody–bait–target complex. The antibody is then used as a handle to immobilize the proteins on inert Sepharose beads that are covalently coupled to Protein A, which stably binds the constant regions of many types of antibodies. At this point, those proteins not immobilized on beads are removed by a series of washes. Finally, the bait-protein complexes are eluted from the beads and dissociated by boiling in SDS. The presence or absence of the target protein, which is the endpoint of the assay, is evaluated by Western blot.” ——————From : Haian Fu edits ,Protein-Protein Interactions:Methods and Applications,Humana Press,2004，338. Haian Fu edits ,Protein-Protein Interactions:Methods and Applications,Humana Press,2004， http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7764403  图1.JPG |
22楼2014-08-20 13:14:17
dingchaoyue
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2楼2014-08-17 11:48:47
ssssllllnnnn 
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【答案】应助回帖
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sakura01_22(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-08-17 20:28:38
sakura01_22: 金币+2 2014-08-19 10:34:54
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sakura01_22(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-08-17 20:28:38
sakura01_22: 金币+2 2014-08-19 10:34:54
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这种情况虽然少见，但却是可以出现的。具体到你的情况： 1、确证用A之抗体Co-IP B的真实性，具体说要有对照（同种属的control IgG对照）。 2、另选一种或几种B的抗体试一试。许多抗体并非适于IP实验，这时只能另选可能用的其他抗体。 3、用其他方法验证A-B间的相互作用（physical interaction），如GST pulldown assays等。 4、可以用mammalian two-hybrid assay在功能上（functional interaction）研究A-B间的相互作用。 Good luck！ |
3楼2014-08-17 12:11:30
sakura01_22
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4楼2014-08-18 16:50:35
