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ayouyiyi

新虫 (初入文坛)

[求助] 请帮忙分析一下,非常感谢~已有7人参与

各位好,小弟近来在做质粒构建,遇到一些问题,请赐教~
原始质粒是从菌液里提出来的pET-28a;目的片段2200左右,上下游引物5'端分别加的是Bamh I和Ecor I的酶切位点,然后也都加好了Neb那张表格的保护碱基,都加了3个保护碱基,PCR条带也都正确,并割胶回收。
然后,质粒和目的片段37度4h双酶切,酶切体系12ul DNA;2ul Buffer K;4.4ul ddH20;0.8ul Bamh I;0.8ul Ecor I,电泳如图1,最左面的是2000的Marker,最右面的是原始质粒。
接着割胶回收,如图2,取割胶回收6.5ul 目的片段和1.5ul 质粒,再加1ul buffer和1ul 连接酶,16度连接20个小时,然后就做转化,感受态效率还可以,明天过来,长了30个左右,晚上接菌,并且在抗生素的培养基里都长了。
但是今天提质粒又是没提出来,已经做了好几次了,这是为什么?试剂盒、限制酶和连接酶都是用的Takara的。
看了原始质粒pET-28a的Bamh I和Ecor I的酶切位点是紧挨着的,是不是不能双酶切?
请不吝赐教,非常感谢~

请帮忙分析一下,非常感谢~
双酶切产物.gif


请帮忙分析一下,非常感谢~-1
双酶切割胶回收.gif
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新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-23 20:29:07
ayouyiyi: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-08-24 10:56:56
片段浓度很低了,切胶一回收这样几乎浓度是不够的。还有,注意到你的空载泳动速度是比你的酶切后的要慢,这是不太正常的,虽然我之前也遇到过,但是问了很多人都说接着连接吧,但我之前的28a的载体一直没有构出来,后来还是果断换了载体,折腾不起
21楼2014-08-23 11:26:47
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新虫 (小有名气)

引用回帖:
22楼: Originally posted by ayouyiyi at 2014-08-24 10:56:49
嗯,您说的正是,我一直都想知道为何,难得是空载28a的构想原因? 准备换载体了,怎么做都搞不定。。。您现在用的是什么载体啊,现在成功了吗,谢谢~~...

嗯,换的全式金的一个商品化的蛋白表达载体pEASY-E2,也是是带his标签的,那个很容易构建的
23楼2014-08-24 15:32:58
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