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各位好，小弟近来在做质粒构建，遇到一些问题，请赐教~ 原始质粒是从菌液里提出来的pET-28a；目的片段2200左右，上下游引物5'端分别加的是Bamh I和Ecor I的酶切位点，然后也都加好了Neb那张表格的保护碱基，都加了3个保护碱基，PCR条带也都正确，并割胶回收。 然后，质粒和目的片段37度4h双酶切，酶切体系12ul DNA；2ul Buffer K；4.4ul ddH20；0.8ul Bamh I；0.8ul Ecor I，电泳如图1，最左面的是2000的Marker，最右面的是原始质粒。 接着割胶回收，如图2，取割胶回收6.5ul 目的片段和1.5ul 质粒，再加1ul buffer和1ul 连接酶，16度连接20个小时，然后就做转化，感受态效率还可以，明天过来，长了30个左右，晚上接菌，并且在抗生素的培养基里都长了。 但是今天提质粒又是没提出来，已经做了好几次了，这是为什么？试剂盒、限制酶和连接酶都是用的Takara的。 看了原始质粒pET-28a的Bamh I和Ecor I的酶切位点是紧挨着的，是不是不能双酶切？ 请不吝赐教，非常感谢~ 双酶切产物.gif 双酶切割胶回收.gif

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