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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 求植物叶片蔗糖磷酸合成酶提取和酶活性测定经验
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qiaomuzhu

金虫 (正式写手)

[求助] 求植物叶片蔗糖磷酸合成酶提取和酶活性测定经验 已有2人参与

本人最近在提取叶片SPS，但是总是测不出酶活性，具体步骤如下，请各位高手来指教：
Hepes缓冲液：50mM Hepes-NaOH（pH7.5）         
                        5mM MgCl2                                                                       
                        1mM Na2-EDTA                                                                  
                        2.5mM DTT                                                                          
                        0.5mg/ml BSA                                                                     
                        10%甘油
SPS reaction mixture：50mM Hepes-NaOH（pH7.5）
                                     15mM MgCl2
                                    25mM Fru-6-P
                                    25mM Glc-6-P
                                    25mM UDPG
本人现将叶片剪碎后，按4ml/g的比例加缓冲液在冰上磨碎(未用液氮)，再用4层纱布过滤，36,000rpm 4℃ 离心10min，取上清用30KD超滤管（SPS 90KD左右）超滤至1ml左右，-80℃保存。测酶活时加70微升的reaction mixture和40微升的粗酶液，37℃，30min，再加70微升30%NaOH（W/V）终止反应，沸水浴5分钟，离心后取上清，加入500微升 0.1%(W/V)和500微升30%HCl（V/V），80℃，10min.
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1楼 2014-07-30 14:45:02
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
qiaomuzhu(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-31 08:58:48
1.你 reaction mixture里的 Glc-6-P是做什么的？你的反应体系里不需要这个底物吧。
2.纱布过滤后的粗酶液可以先不用超滤管浓缩直接先来个酶活检测。你的酶液不至于浓度低到只能做浓缩才能测到酶活的地步，至于蛋白的浓缩那是后话。
3.叶片破碎可以加点玻璃珠辅助研磨或者液氮研磨
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大家相互帮助哈
2楼2014-07-31 01:30:53
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qiaomuzhu

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-31 01:30:53
1.你 reaction mixture里的 Glc-6-P是做什么的？你的反应体系里不需要这个底物吧。
2.纱布过滤后的粗酶液可以先不用超滤管浓缩直接先来个酶活检测。你的酶液不至于浓度低到只能做浓缩才能测到酶活的地步，至于蛋白 ...

Glc-6-P,看到文献里面都有加这个，但并不是反应底物，因为现在测不出酶活，所以就没去检测它是否有用。是可以用浓缩之前的粗酶液测一下。研磨的时候加了石英砂，加液氮的话会损失酶的活性，我之前就做过另外一种酶，活性损失接近一半。
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3楼2014-07-31 11:30:10
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
qiaomuzhu: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-08-01 12:55:03
1.Glc-6-P既然不是必须的底物就不要加了。说不定会有额外的抑制。
2.你的测定方法和反应条件都很正常，问题应该还是在提取粗酶液上。我记得SPS这个酶不稳定，丰度也很低，在植物中还对光敏感。因此你破碎叶片的时候最好迅速，温度尽量也要低一些。叶片在提取前最好光照处理一下，粗酶液收集完就测。
3.你的离心力12000g就好，不需要那么高的转速。
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大家相互帮助哈
4楼2014-08-01 02:23:10
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qiaomuzhu

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-08-01 02:23:10
1.Glc-6-P既然不是必须的底物就不要加了。说不定会有额外的抑制。
2.你的测定方法和反应条件都很正常，问题应该还是在提取粗酶液上。我记得SPS这个酶不稳定，丰度也很低，在植物中还对光敏感。因此你破碎叶片的时候 ...

非常感谢你的回复，我再改进一下实验方案

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5楼2014-08-01 12:54:43
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labrat

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
qiaomuzhu: 金币+17, ★★★很有帮助 2014-08-02 00:25:18
tips;
1. inorganic phosphate may inhibit SPS activity, avoid plant and cross contamination.
2. trial: crush leaves using liquid N2, extract and test SPS activity after crude extraction
3. test protein Abs280nm, if no protein, no need to further work, review extraction protocol.
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6楼2014-08-01 13:49:17
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qiaomuzhu

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-08-01 02:23:10
1.Glc-6-P既然不是必须的底物就不要加了。说不定会有额外的抑制。
2.你的测定方法和反应条件都很正常，问题应该还是在提取粗酶液上。我记得SPS这个酶不稳定，丰度也很低，在植物中还对光敏感。因此你破碎叶片的时候 ...

按照你说的方法重新试过，还是没有活性，我真是悲剧了。

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7楼2014-08-17 17:52:33
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tang686898

铜虫 (小有名气)
您好，我也要做类似的实验，但不知道从哪买到这些药品，网上试剂公司说都是含盐的，可否推荐一家试剂公司，是不是不存在不含盐的Fru 6-P，Glc 6-P，UDP？
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8楼2015-06-23 10:43:06
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