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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 用间苯二酚法测定蔗糖合成酶活性的疑惑
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qiaomuzhu

金虫 (正式写手)

[求助] 用间苯二酚法测定蔗糖合成酶活性的疑惑已有1人参与

果糖+UDPG---->蔗糖+UDP，这是蔗糖合成酶催化的一个可逆反应。我的疑惑是：果糖和UDPG在蔗糖合成酶的催化下生成蔗糖，而间苯二酚法是通过间苯二酚和HCl将蔗糖水解成果糖和葡萄糖，使果糖和间苯二酚结合，80℃水浴后生成红色物质，测OD480吸光值，如果之前的果糖没有反应完全，那岂不是对测OD480有影响，实验结果将会不准确。
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1楼2014-07-26 19:25:20
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
qiaomuzhu(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2014-07-26 21:29:32
qiaomuzhu: 金币+7, ★★★★★最佳答案, 一直不明白NaOH的作用，非常感谢你的回复！ 2014-07-26 23:01:09
你的这个酶活测定方法肯定在酶液和果糖与UDPG反应后加了一步对原始底物的处理，比如用少量强碱（NaOH之类）加热处理你的反应液，原先的果糖在加热的强碱下非常快就全分解了，然后再加酸处理你的蔗糖分解为果糖和葡萄糖，通过测定果糖和间苯二酚的颜色的吸光值来表征蔗糖的生成量。如果没有处理底物这一步的话肯定是不行的。
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2楼2014-07-26 21:19:57
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qiaomuzhu

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-26 21:19:57
你的这个酶活测定方法肯定在酶液和果糖与UDPG反应后加了一步对原始底物的处理，比如用少量强碱（NaOH之类）加热处理你的反应液，原先的果糖在加热的强碱下非常快就全分解了，然后再加酸处理你的蔗糖分解为果糖和葡萄 ...

想在请教一下，由于蔗糖合酶催化的是可逆反应，当催化蔗糖和UDP分解成果糖和UDPG时，用间苯二酚加HCl测果糖，怎样才能消除蔗糖分解带来的影响。望指教。

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3楼2014-07-26 23:48:22
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-27 09:36:01
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3楼: Originally posted by qiaomuzhu at 2014-07-26 23:48:22
想在请教一下，由于蔗糖合酶催化的是可逆反应，当催化蔗糖和UDP分解成果糖和UDPG时，用间苯二酚加HCl测果糖，怎样才能消除蔗糖分解带来的影响。望指教。
...

你是担心这个反应由于是可逆的，产物蔗糖又能在酶催化下形成果糖而影响后期酶活测定吗?
虽然是个可逆反应，但是酶促反应在初期你的底物非常充足的情况下还是以果糖到蔗糖的为主（一般酶活测定的方法都会明确底物和酶液具体反应多长时间），而且你的底物和酶反应后肯定还有个高温处理底物与酶液混合物终止反应的，其实就是高温失活酶防止后期酶的可逆反应对整个酶活测定体系的影响。
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4楼2014-07-27 00:30:38
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qiaomuzhu

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-27 00:30:38
你是担心这个反应由于是可逆的，产物蔗糖又能在酶催化下形成果糖而影响后期酶活测定吗?
虽然是个可逆反应，但是酶促反应在初期你的底物非常充足的情况下还是以果糖到蔗糖的为主（一般酶活测定的方法都会明确底物和 ...

我想说的是我要通过控制pH值，分别测蔗糖合酶在合成方向和分解方向的活性，当然反应最终肯定是有高温终止酶反应的。我想问的是，当我控制pH值，只进行分解方向反应，是蔗糖和UDP分解成果糖和UDPG，通过间苯二酚测果糖的含量，但是却不知道怎样抑制没有反应完的蔗糖在酸性环境下分解成果糖，影响果糖测定，昨天晚上想了想，这一步是可以用DNS的，当然能够用间苯二酚最好了。

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5楼2014-07-27 10:07:51
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by qiaomuzhu at 2014-07-27 10:07:51
我想说的是我要通过控制pH值，分别测蔗糖合酶在合成方向和分解方向的活性，当然反应最终肯定是有高温终止酶反应的。我想问的是，当我控制pH值，只进行分解方向反应，是蔗糖和UDP分解成果糖和UDPG，通过间苯二酚测果 ...

你要测分解反应底物肯定是换成了蔗糖和UDP吧，你这个反应所用的pH值很低吗，需要加缓冲液吧？你可以做个对照实验，就是不加酶只加底物和缓冲液，其他条件和你测酶活的条件一样，最后用间苯二酚显色一下，如果有颜色的话这个方法就不合适了。
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6楼2014-07-27 14:58:53
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实验小白!

新虫 (初入文坛)
虽然发帖时间过去挺久得了，但还是希望得到你的指教。

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7楼2018-03-13 16:28:40
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实验小白!

新虫 (初入文坛)
我想测蔗糖合成酶，按指导书上用间苯二酚法测蔗糖，标准曲线不显得，样品显色但是OD值重复的不好，想知道你们没有这个问题么

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8楼2018-03-13 16:30:29
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