应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 求植物叶片蔗糖磷酸合成酶提取和酶活性测定经验
51/1返回列表
查看: 2811  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

qiaomuzhu

金虫 (正式写手)

[求助] 求植物叶片蔗糖磷酸合成酶提取和酶活性测定经验 已有2人参与

本人最近在提取叶片SPS，但是总是测不出酶活性，具体步骤如下，请各位高手来指教：
Hepes缓冲液：50mM Hepes-NaOH（pH7.5）         
                        5mM MgCl2                                                                       
                        1mM Na2-EDTA                                                                  
                        2.5mM DTT                                                                          
                        0.5mg/ml BSA                                                                     
                        10%甘油
SPS reaction mixture：50mM Hepes-NaOH（pH7.5）
                                     15mM MgCl2
                                    25mM Fru-6-P
                                    25mM Glc-6-P
                                    25mM UDPG
本人现将叶片剪碎后，按4ml/g的比例加缓冲液在冰上磨碎(未用液氮)，再用4层纱布过滤，36,000rpm 4℃ 离心10min，取上清用30KD超滤管（SPS 90KD左右）超滤至1ml左右，-80℃保存。测酶活时加70微升的reaction mixture和40微升的粗酶液，37℃，30min，再加70微升30%NaOH（W/V）终止反应，沸水浴5分钟，离心后取上清，加入500微升 0.1%(W/V)和500微升30%HCl（V/V），80℃，10min.
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-07-30 14:45:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tang686898

铜虫 (小有名气)
您好，我也要做类似的实验，但不知道从哪买到这些药品，网上试剂公司说都是含盐的，可否推荐一家试剂公司，是不是不存在不含盐的Fru 6-P，Glc 6-P，UDP？
赞一下 回复此楼
8楼2015-06-23 10:43:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答

luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
qiaomuzhu(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-31 08:58:48
1.你 reaction mixture里的 Glc-6-P是做什么的？你的反应体系里不需要这个底物吧。
2.纱布过滤后的粗酶液可以先不用超滤管浓缩直接先来个酶活检测。你的酶液不至于浓度低到只能做浓缩才能测到酶活的地步，至于蛋白的浓缩那是后话。
3.叶片破碎可以加点玻璃珠辅助研磨或者液氮研磨
赞一下 回复此楼
大家相互帮助哈
2楼2014-07-31 01:30:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qiaomuzhu

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-31 01:30:53
1.你 reaction mixture里的 Glc-6-P是做什么的？你的反应体系里不需要这个底物吧。
2.纱布过滤后的粗酶液可以先不用超滤管浓缩直接先来个酶活检测。你的酶液不至于浓度低到只能做浓缩才能测到酶活的地步，至于蛋白 ...

Glc-6-P,看到文献里面都有加这个，但并不是反应底物，因为现在测不出酶活，所以就没去检测它是否有用。是可以用浓缩之前的粗酶液测一下。研磨的时候加了石英砂，加液氮的话会损失酶的活性，我之前就做过另外一种酶，活性损失接近一半。
赞一下 回复此楼
3楼2014-07-31 11:30:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
qiaomuzhu: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-08-01 12:55:03
1.Glc-6-P既然不是必须的底物就不要加了。说不定会有额外的抑制。
2.你的测定方法和反应条件都很正常，问题应该还是在提取粗酶液上。我记得SPS这个酶不稳定，丰度也很低，在植物中还对光敏感。因此你破碎叶片的时候最好迅速，温度尽量也要低一些。叶片在提取前最好光照处理一下，粗酶液收集完就测。
3.你的离心力12000g就好，不需要那么高的转速。
赞一下 回复此楼
大家相互帮助哈
4楼2014-08-01 02:23:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +16 爱看书的可乐 2026-08-26 18/900 2026-08-28 17:09 by winsaint
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +11 Kittylucky 2026-08-27 12/600 2026-08-28 16:26 by lyxiaomc
[教师之家] 导师吐槽：我怎么摊上了这么个极品研究生！ +8 苏东坡二世 2026-08-23 8/400 2026-08-28 14:41 by lkforward
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 面上合作单位盖章 +5 ssyjh 2026-08-27 5/250 2026-08-27 20:50 by gdfollow
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[文学芳草园] 梦想 +3 myrtle 2026-08-26 3/150 2026-08-27 10:01 by angelyueyi
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +9 炎黄贵胄 2026-08-22 10/500 2026-08-26 15:40 by semaglutide
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +23 koalala 2026-08-24 26/1300 2026-08-26 14:29 by 宝贝虫子
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[职场人生] 学生撞见辅导员送外卖，第二天全班都沉默了 +3 鲸鱼融金_浙江_� 2026-08-22 3/150 2026-08-26 09:01 by zzuzxg
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
[基金申请] 明天应该可查了！？ +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭