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smily527

铜虫 (初入文坛)

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[求助] 有关糖代谢酶，谁做过，请帮我想想解决的办法，急，谢谢已有1人参与

SPS活性测定参照Komatsu等、Lowell等、Hubbard等和陈俊伟的方法，并加以改进。在80μl  反应体系中含 50mmol/L Hepes一NaoH缓冲液 (pH7.5),15mmol/LMgcl2，1mmol/L一1EDTA,5mmol/L NaF，10mmol/L UDPG,4mmol/L F一6一P,20mmol/L G一6一P，酶提取液;300C反应 30min，然后加入60μl 5mol/LNaOH终止反应，最后沸水浴 10min，冷却后加入1ml 0.14%的蒽酮(溶解在13.8mol/L 的H2SO4中，即0.14g蒽酮溶解在76ml H2SO4 +30ml水中)400C反应20min,测定A620。对照反应体系中不含Fru 6-P和Glc 6-P。。酶活力以单位鲜果重中的酶在单位时间内催化底物生成蔗糖的μmol数表示。单位为：μmol．h-1．g-1FW(FW指果实鲜重)。

SS合成方向的活性测定参照Lowell等、Hubbard等和陈俊伟的方法，并加以改进。在60μl反应体系中含 80mmol/LHpes一NaoH缓冲液 (pH7.5),5mmol/L KCN, 5mmol/L NaF,100mmol/L 果糖，10mmol/L UDPG，酶提取液;300C应 30min，加入60 μl 5mmol/LNaoH终止反应，沸水浴 10min，冷却后加入1ml 0.14%的蒽酮(溶解在13.8mol/L 的H2SO4，中，即0.14g蒽酮溶解在76ml H2SO4 +30ml水中)400C反应20min,测定A620。对照反应体系中不含果糖。酶活力以单位鲜果重中的酶液在单位时间内催化底物生成蔗糖的μmol数表示。单位为：μmol．h-1．g-1．FW(FW指果实鲜重)。

SS分解方向的活性测定参考Lowell等和陈俊伟的方法。在490μl反应体系中含80 mmol/L Mes缓冲液(pH 5．5)，(5mmol/L NaF,100mmol/L蔗糖， 5mmol/LUDP)，酶提取液;300C反应 30min，加入490μlDNS(称6.3g 3，5一二硝基水扬酸溶解于水中，加2.1g NaOH和185g酒石酸钾钠后，加水(煮沸十分钟后冷却密封)500mL，加热溶解后，加重蒸酚5g，无水亚硫酸钠 5g，加热搅拌，冷却后定容至1000mL，贮存于棕色瓶中，放置一周之后使用)试剂终止反应，沸水浴 5min，冷却后测定A540。对照反应体系中不含UDP. 酶活力以单位鲜果重中的酶液在单位时间内催化底物生成蔗糖的μmol数表示。单位为：μmol．h-1．g-1．FW(FW指果实鲜重)。

酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI)的测定按照Merlo和Passera(1991)的方法，略有改动。反应液总体积为l ml，包括：o．1 mol /L乙酸钠-乙酸(pH 4．8，对酸性转化酶)或O．1 mol /L磷酸氢二钾,0．1 mol /L柠檬酸钠-柠檬酸(pH 7．2，对中性转化酶)，0．1 mol /L蔗糖和O．1 ml酶液。在370C保温40 min后，加1 ml 3，5-二硝基水杨酸试剂终止反应，准确煮沸5 min，冷却，测定A520，即测定从蔗糖释放还原糖的量。用酶空白作对照，底物空白用参比。酶空白只含有酶液和反应液，不含底物：底物空白只含有底物和反应液，不含酶液，其它步骤相同。
这是我的方法，但是我做出来不对。
1;  我用上面的蒽酮比色法做蔗糖的标曲，加入我配好的0.14%的蒽酮(溶解在13.8mol/L 的H2SO4，中，即0.14g蒽酮溶解在76ml H2SO4 +30ml水中）之后，蔗糖溶液全部产生乳白色的絮状物，不知道到底是什么原因
2,  我用dns法做葡萄糖标曲时，葡萄糖浓度为500微克每毫升开始煮沸后后冷却就产生絮状物，加热又会溶解，完全在书上坐标曲的浓度范围之内，不知道这是咋咋回事
3，我测酶活性时空白里不加每，只加底物和反应液，应该没问题吧，但是测出来的数据还是有问题，请指点
非常感谢

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