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merry2004120

银虫 (小有名气)

[求助] 请帮忙看看这个PCR后电泳结果，谢谢！ 已有1人参与

质粒大小>7kbp。
目的基因：772bp。
引物：Tm：57°C。
按质粒浓度设了4个梯度，每个梯度分3管，同时进行PCR。

PCR反应条件：
第一阶段：94°C，2min
第二阶段：94°C，30s；52°C，30s；72°C，47s；30个循环
第三阶段：72°C，5min

加样：
孔1：Marker D2000。孔2：产物加到孔外边了。
孔3、4、5：高浓度质粒。
孔6、7、8：中高浓度质粒。
孔9、10、11：中低浓度质粒。
孔12、13、14：低浓度质粒。
孔15：未加样。

结果如图：
图一：电泳20min时拍的。
图二：之后又跑了5min。

问题：我们得到的条带是目的基因还是质粒？为什么同样浓度质粒，三管PCR后有的出现条带，有的没有条带？下一步该怎么做？

希望得到高手指点。
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1楼 2014-07-29 21:58:59
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kuaile5420

专家顾问 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
merry2004120: 金币+1 2014-07-30 20:29:40
你好，看你的电泳结果，根本没有P出来目的片段啊？显示的条带都是大于2000bp的，应该是质粒；是不是你的质粒浓度太高，不利于PCR尝试着做个稀释之后再做一下PCR。
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坚持到底就是胜利！
2楼2014-07-30 16:03:38
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merry2004120

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kuaile5420 at 2014-07-30 16:03:38
你好，看你的电泳结果，根本没有P出来目的片段啊？显示的条带都是大于2000bp的，应该是质粒；是不是你的质粒浓度太高，不利于PCR尝试着做个稀释之后再做一下PCR。

今天又做了一次电泳，左边第一个亮带加的是原始质粒，右边的是Marker，中间所加样品顺序与昨天相同。
感觉P出来的和质粒不在同一水平。

请高手指点！
请帮忙看看这个PCR后电泳结果，谢谢！
质粒+PCR-2014-7-30.jpg
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3楼2014-07-30 20:28:43
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kuaile5420

专家顾问 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
merry2004120: 金币+1 2014-07-31 23:35:33
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-01 10:31:57
嗯，加入了原质粒，可以看出跑出来的条带不是质粒条带而是PCR产生的条带，但是不是目的基因的条带：我推测由两个原因，其一，可能是你的预变性时间（即你的第一阶段）时间太短，只有两分钟，导致变性不完全，影响了后面的PCR，适当延长一下预变性的时间，eg，5min；其二，可能是引物的问题，引物设计存在问题导致没有P出自己想要的目的基因，而是P出了别的基因，这个就要重新设计引物了。还有一个问题就是有些泳道根本没有条带：推测原因如下，可能是没有提取到质粒，提取之后你做鉴定了吗？是鉴定之后跑的PCR吗？
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4楼2014-07-30 21:06:40
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merry2004120

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by kuaile5420 at 2014-07-30 21:06:40
嗯，加入了原质粒，可以看出跑出来的条带不是质粒条带而是PCR产生的条带，但是不是目的基因的条带：我推测由两个原因，其一，可能是你的预变性时间（即你的第一阶段）时间太短，只有两分钟，导致变性不完全，影响了 ...

请问：您所指的鉴定是分光光度计吗？P后电泳不就是为了鉴定吗？
请指教！
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5楼2014-07-31 23:27:48
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merry2004120

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by kuaile5420 at 2014-07-30 21:06:40
嗯，加入了原质粒，可以看出跑出来的条带不是质粒条带而是PCR产生的条带，但是不是目的基因的条带：我推测由两个原因，其一，可能是你的预变性时间（即你的第一阶段）时间太短，只有两分钟，导致变性不完全，影响了 ...

还有我们的目的基因没有内含子，而PCR用的是原始质粒，能不能因为P时把内含子一起带出来了，所以P出的条带不在700多，而在2000左右？
可以这样解释吗？
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6楼2014-07-31 23:32:09
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kuaile5420

专家顾问 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by merry2004120 at 2014-07-31 23:27:48
请问：您所指的鉴定是分光光度计吗？P后电泳不就是为了鉴定吗？
请指教！...

电泳是为了鉴定啊，提取到质粒之后跑电泳，确定你提到了质粒，这样就可以知道你的样品中，没有PCR结果的几个样是否有质粒。
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7楼2014-08-01 10:45:13
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kuaile5420

专家顾问 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by merry2004120 at 2014-07-31 23:32:09
还有我们的目的基因没有内含子，而PCR用的是原始质粒，能不能因为P时把内含子一起带出来了，所以P出的条带不在700多，而在2000左右？
可以这样解释吗？...

亲，原核质粒是没有内含子的吧？
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8楼2014-08-01 10:47:17
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