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请帮忙看看这个PCR后电泳结果，谢谢！ 已有1人参与
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质粒大小>7kbp。 目的基因：772bp。 引物：Tm：57°C。 按质粒浓度设了4个梯度，每个梯度分3管，同时进行PCR。 PCR反应条件： 第一阶段：94°C，2min 第二阶段：94°C，30s；52°C，30s；72°C，47s；30个循环 第三阶段：72°C，5min 加样： 孔1：Marker D2000。孔2：产物加到孔外边了。 孔3、4、5：高浓度质粒。 孔6、7、8：中高浓度质粒。 孔9、10、11：中低浓度质粒。 孔12、13、14：低浓度质粒。 孔15：未加样。 结果如图： 图一：电泳20min时拍的。 图二：之后又跑了5min。 问题：我们得到的条带是目的基因还是质粒？为什么同样浓度质粒，三管PCR后有的出现条带，有的没有条带？下一步该怎么做？ 希望得到高手指点。 |
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- 附件 2 : PCR22014-07-29_14_时_01_分.tif
2014-07-29 21:35:29, 18.55 M
2014-07-29 21:35:54, 14.65 M
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-01 10:31:57
| 嗯，加入了原质粒，可以看出跑出来的条带不是质粒条带而是PCR产生的条带，但是不是目的基因的条带：我推测由两个原因，其一，可能是你的预变性时间（即你的第一阶段）时间太短，只有两分钟，导致变性不完全，影响了后面的PCR，适当延长一下预变性的时间，eg，5min；其二，可能是引物的问题，引物设计存在问题导致没有P出自己想要的目的基因，而是P出了别的基因，这个就要重新设计引物了。还有一个问题就是有些泳道根本没有条带：推测原因如下，可能是没有提取到质粒，提取之后你做鉴定了吗？是鉴定之后跑的PCR吗？ |
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