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Changhua1989新虫 (初入文坛)
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表观遗传学实验——染色质免疫沉淀相关问题？ 已有2人参与
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本人之前是做微生物分子生态学的，最近由于工作需要，在学习表观遗传学，以前做学生没好好学分子生物学，现在看遗传这方面真是云里雾里的， 其中关于染色质免疫沉淀实验部分，一直搞不懂，它的研究目的是体内DNA与蛋白质相互作用，问几个问题：1. 这里的蛋白质，是不是就只是指组蛋白？ 2. DNA从组蛋白分开来不是拿去测序了吗？这时组蛋白作什么用？怎么研究它们间的关系？ 3. 实验中用抗原抗体的方法进行沉淀，这里的抗体是针对组蛋白设计的吗？ 4. 组蛋白不是都一样吗？难道不同基因的组蛋白不同？ 5. DNA拿去测序，也不能了解其甲基化情况吧？那测序到底什么用处？ 问的问题很幼稚，还请学霸们耐心解答！非常感谢！ |
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【答案】应助回帖
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Changhua1989: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-07-28 09:12:49
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有关ChIP的问题已经有朋友问起。在另一个帖子中我做了具体的回答，建议楼主到这个帖子去可以下： http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7701737&pid=8#pid8 以下是我刚刚进一步回答的一个问题，希望对上述几位同道有帮助： ChIP的主要用途是确定DNA结合蛋白（如转录因子等）是否与基因的某部位结合。以转录因子A举例说明： 转录因子A一定有许多受其调节的靶基因，假定你怀疑B基因可能是转录因子A的靶基因，那么你要回答的问题首先是A对B在转录水平上有直接调节作用；然后是回答A是否与B的调控区域（增强子/启动子区域）结合，只有结合了才会在转录水平上对B调节。作为转录因子，与靶基因相互作用一般都通过一段concensus顺序，即所谓的response elements实现的，所以在回答此问题之前，要对靶基因B的调控区进行分析，看有无转录因子A的可能结合顺序，一般可能不只一个，如果有这样的顺序，就更加支持B是A的靶基因的判断。接下来就要具体研究A与B调控区域的结合情况，此时就用的ChIP assay. 具体说，用A的抗体进行IP，然后用B调控区中含有A结合的response elements附近的上下游引物对沉淀物中的DNA进行PCR。如果有产物就证实A与B的调控区结合。当然需要有对照，对照可以采用距离response elements有一段距离的上下游引物进行扩增。理论上对照引物是不该有扩增产物的。到此为止，就把所要回答的问题回答了。当然，严格说来，实验还没有结束，还应该用B调控区域做一个reporter gene（包括respnse elements wild-type和mutants），然后用transient transfection观察转录因子A对B基因调控区所控制的报告基因表达的诱导情况，具体说，如果所用response elements是野生型，则该reporter会受A的调控，若是突变型，则不再手A的调控。至此，整个问题算是大致完整解决了。 除了主要上述应用之外，偶尔也可以用于寻找转录因子的靶基因。仍以上述转录因子A为例，为了寻找A的靶基因，可以用A的抗体做IP，然后将所获得的DNA片段进行克隆，并进行序列测定，最后按照A的concensus response elements进行分析所得到的诸多克隆是否含有A的结合位点而筛出A的可能靶基因（调控区）。这部分也许是你所理解的内容？ |
6楼2014-07-28 03:23:28
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【答案】应助回帖
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西门吹雪170: 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2015-01-11 18:53:04
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那要对B基因的调控顺序进行分析预测，看上面有哪些可能的response elements，也就是可能的转录因子结合位点或反应元件，在此基础上进行验证。验证步骤基本包括： 1、构建由B基因调控序列（启动子+增强子顺序）调控的报告基因，用此进行transient transfection luciferase assay（向细胞中共转染该报告基因和可能的转录因子表达载体），看所表达的转录因子是否对该报告基因有调控作用； 2、如果1有预期的结果，则进一步对可能的response elements进行突变，再按1的方法重复上述实验，目的是验证转录因子对B的调节作用确系由所推定的response elements介导。 3、在上述基础上，检测转录因子A对内源性B基因的表达调控，两个方面：一是向细胞中转染转录因子A，看B基因的表达（mRNA和蛋白）；另一方面，用siRNA knockdown转录因子A的表达，再看B基因的表达。 4、可以用ChIP assay验证转录因子A确是与内源性B基因之调控序列结合。 5、其他功能意义上的进一步研究。 希望有帮助，并祝顺利！ |
10楼2015-01-11 02:04:13
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