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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » EMSA/ChIP » 表观遗传学实验——染色质免疫沉淀相关问题？
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Changhua1989

新虫 (初入文坛)

[求助] 表观遗传学实验——染色质免疫沉淀相关问题？已有2人参与

本人之前是做微生物分子生态学的，最近由于工作需要，在学习表观遗传学，以前做学生没好好学分子生物学，现在看遗传这方面真是云里雾里的，
其中关于染色质免疫沉淀实验部分，一直搞不懂，它的研究目的是体内DNA与蛋白质相互作用，问几个问题：1. 这里的蛋白质，是不是就只是指组蛋白？ 2. DNA从组蛋白分开来不是拿去测序了吗？这时组蛋白作什么用？怎么研究它们间的关系？ 3. 实验中用抗原抗体的方法进行沉淀，这里的抗体是针对组蛋白设计的吗？ 4. 组蛋白不是都一样吗？难道不同基因的组蛋白不同？ 5. DNA拿去测序，也不能了解其甲基化情况吧？那测序到底什么用处？
问的问题很幼稚，还请学霸们耐心解答！非常感谢！
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1楼2014-07-27 10:23:58
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2015-01-11 18:53:04
引用回帖:
9楼: Originally posted by totoro626 at 2015-01-09 04:14:23
借您的回答接过来问个问题，要研究A转录因子对B基因的直接调控作用可以用CHIP和report gene；不知道B基因存在的情况下，可以做A转录因子的CHIP-sequence看看A可以调控哪些基因；那么反过来，我只知道B基因，想研究 ...

那要对B基因的调控顺序进行分析预测，看上面有哪些可能的response elements，也就是可能的转录因子结合位点或反应元件，在此基础上进行验证。验证步骤基本包括：
1、构建由B基因调控序列（启动子+增强子顺序）调控的报告基因，用此进行transient transfection luciferase assay（向细胞中共转染该报告基因和可能的转录因子表达载体），看所表达的转录因子是否对该报告基因有调控作用；
2、如果1有预期的结果，则进一步对可能的response elements进行突变，再按1的方法重复上述实验，目的是验证转录因子对B的调节作用确系由所推定的response elements介导。
3、在上述基础上，检测转录因子A对内源性B基因的表达调控，两个方面：一是向细胞中转染转录因子A，看B基因的表达（mRNA和蛋白）；另一方面，用siRNA　knockdown转录因子A的表达，再看B基因的表达。
4、可以用ChIP assay验证转录因子A确是与内源性B基因之调控序列结合。
5、其他功能意义上的进一步研究。

希望有帮助，并祝顺利！
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10楼2015-01-11 02:04:13
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蜂鸟404

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-27 19:19:41
Changhua1989: 金币+1, ★有帮助 2014-07-28 09:11:55
不止是组蛋白吧，组蛋白是否一样我不知道，但还有一种叫转录因子的蛋白也能和DNA相互作用从而直接或间接调控基因的表达，一般研究转录因子就要研究它调控的基因，和它具体和DNA哪一段序列结合，这是做免疫共沉淀后对DNA测序就有必要了

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2楼2014-07-27 11:32:59
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Changhua1989

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 蜂鸟404 at 2014-07-27 11:32:59
不止是组蛋白吧，组蛋白是否一样我不知道，但还有一种叫转录因子的蛋白也能和DNA相互作用从而直接或间接调控基因的表达，一般研究转录因子就要研究它调控的基因，和它具体和DNA哪一段序列结合，这是做免疫共沉淀后对 ...

还是不太懂，怎么确定蛋白对应的DNA？根据氨基酸序列反推的DNA吗？
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3楼2014-07-27 14:25:20
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蜂鸟404

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Changhua1989 at 2014-07-27 14:25:20
还是不太懂，怎么确定蛋白对应的DNA？根据氨基酸序列反推的DNA吗？...

这是一个难点，你可以查一下，结合是靠空间结构域，所以不能看氨基酸序列

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4楼2014-07-27 14:42:31
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