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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒提取
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55liuyan

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Renjingyu(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-06-30 21:06:09
第一种可能，你没有挑上菌；
第二种可能，假阳性，即你的板子倒得不均匀，也许某些区域不带有筛选压力；
第三种可能，提质粒的过程出了问题，比如第一步菌液没有完全吸干，对后面的结果会造成非常大的影响。
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每日三省吾身，平静，定气
21楼2014-06-30 12:14:22
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长相思

银虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2014-06-30 12:13:09
你这个很有可能是假阳性的，所以不是你培养基或者提质粒什么的问题。一般菌P要很亮才可能是阳性菌。重新连接转化吧
...

假阳性也可以培养出菌的吧！只是酶切后size不对而已。
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未来很美好
22楼2014-06-30 20:54:11
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 长相思 at 2014-06-30 20:54:11
假阳性也可以培养出菌的吧！只是酶切后size不对而已。...

有时候可能就摇不起来，不是酶切后大小不对，是根本就切不开
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天道酬勤
23楼2014-06-30 21:45:02
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
Renjingyu(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-16 08:58:55
引用回帖:
3楼: Originally posted by Renjingyu at 2014-06-28 10:48:11
转化--涂板--菌p--摇菌 其中菌落pcr验证正确，就是摇不出菌，有没有可能我的转化做的就不对？我确定培养基是没问题的...

“转化--涂板--菌p--摇菌 其中菌落pcr验证正确“
如何断定你的菌落PCR正确，也就是克隆是阳性的，你是如何排除假阳性的，如果菌落PCR做的不好的话，很可能就会出现假阳性
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
24楼2014-07-15 20:49:26
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
17楼: Originally posted by Renjingyu at 2014-06-30 10:43:39
不是很亮，但挑了5个斑都有很浅的条带...

不是很亮，挑了5个斑都有很浅的条带，这说明你的菌落都是假阳性，你摇菌后抽不到质粒也就很正常了
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
25楼2014-07-15 20:51:01
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古木宁天

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by Renjingyu at 2014-06-28 22:11:22
用的都是大肠杆菌
...

亲，大肠杆菌是无抗的，只有转入的质粒上有抗性标记，确定抗性没问题？
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懒
26楼2014-07-15 21:30:43
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-06-28 13:02:40
1、你到底是菌要摇出来没有？如果没有，要考虑你的培养基，还有你是否有挑到克隆，以及你摇菌的转速和时间
2、抽不出质粒的话，检查一下你所用的试剂是否有问题，自己的操作是否有出现错误
3、既然菌液PCR都出来了 ...

楼主，我的是菌液pcr有目的条带，也有杂带，但是杂带比较暗，质粒的浓度好低，20-30ng正常吗？酶切的时候没有目的产物
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踏实
27楼2014-07-15 23:43:03
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
引用回帖:
27楼: Originally posted by hajierlove at 2014-07-15 23:43:03
楼主，我的是菌液pcr有目的条带，也有杂带，但是杂带比较暗，质粒的浓度好低，20-30ng正常吗？酶切的时候没有目的产物...

质粒浓度太低，建议精抽后酶切
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
28楼2014-07-16 08:50:54
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2014-07-16 13:01:00
碰到这种情况，说不清道不明。我也碰到过，摇起来提不出质粒来。  师兄说可能是噬菌体污染了。
我就换了电转化感受态就好了。
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29楼2014-07-16 11:14:25
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
27楼: Originally posted by hajierlove at 2014-07-15 23:43:03
楼主，我的是菌液pcr有目的条带，也有杂带，但是杂带比较暗，质粒的浓度好低，20-30ng正常吗？酶切的时候没有目的产物...

菌液pcr有目的条带不一定就是阳性克隆，也可能是假阳性，做菌落PCR的时候，最好不好全用你基因的引物，可以配合载体上的一条引物做，这样可以消除假阳性
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
30楼2014-07-16 13:00:44
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