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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 做过反向PCR的筒子进来看一下吧
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shellyxss

金虫 (正式写手)

[求助] 做过反向PCR的筒子进来看一下吧 已有1人参与

我在做反向PCR是时候，方法里面说自身环化以后需要用乙醇沉淀环化产物，这个乙醇沉淀是怎么沉淀的啊？麻烦知道的筒子告知一下呗~谢谢各位啦~
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1楼 2014-06-01 10:21:06
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by shellyxss at 2014-06-03 08:44:10
昨天按照这个方法做了，但是没有看到沉淀，这是正常的吗？...

如果你反向PCR扩增出来的条带并不是太亮的话，加入乙醇没有看到白色沉淀很正常，但你加了水后去测核酸浓度还是可以测到的。如果沉淀效果不好，DNA、乙醇和醋酸钠混合后可以在-20度多放一段时间，我一般都是晚上混合好放-20度放一晚上第二天早上来离心，每次都可以离心下来沉淀。还有你初始DNA的浓度也对后期浓缩影响很大，你的反向PCR做完条带亮吗，割胶回收后是不是又T4酶连了？最好乙醇浓缩前先测一个初始核酸浓度，如果初始浓度就太低的话，乙醇沉淀也很难成功。
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大家相互帮助哈
8楼2014-06-03 12:16:14
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
就是传统的DNA浓缩。向1体积的质粒溶液加入2.5体积冰置或者-20度放置的无水乙醇，再加入0.1倍 3M、pH5.2醋酸钠溶液,之后将混合液-20度静置30min以上(网上也有-70度放3min，不过我没试过），12000rpm   下4度 离心10min，小心弃去液体，之后再用75%乙醇漂洗一遍，12000rpm离心弃去乙醇后，真空干燥或者室温静置晾干残余乙醇，最后用一定体积的水或缓冲液溶解即可。
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大家相互帮助哈
2楼2014-06-01 21:20:27
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shellyxss

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-01 21:20:27
就是传统的DNA浓缩。向1体积的质粒溶液加入2.5体积冰置或者-20度放置的无水乙醇，再加入0.1倍 3M、pH5.2醋酸钠溶液,之后将混合液-20度静置30min以上(网上也有-70度放3min，不过我没试过），12000rpm   下4度 离心10 ...

请问为什么需要用醋酸钠溶液啊？
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3楼2014-06-02 15:50:15
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shellyxss

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-01 21:20:27
就是传统的DNA浓缩。向1体积的质粒溶液加入2.5体积冰置或者-20度放置的无水乙醇，再加入0.1倍 3M、pH5.2醋酸钠溶液,之后将混合液-20度静置30min以上(网上也有-70度放3min，不过我没试过），12000rpm   下4度 离心10 ...

啊，还有配置的醋酸钠溶液是不是需要高压蒸汽灭菌呢？
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4楼2014-06-02 16:10:29
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